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梅雪芳新蟲 (小有名氣)
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[交流]
原代肝細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)
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最近在分離小鼠原代肝細(xì)胞做MTT，但是遇到一些問題，我的操作過程如下： 1、無菌獲取乳鼠肝組織，剪碎至1mm3大小，4℃ DMEM清洗血 2、約2倍于肝組織體積的0.25%胰酶消化3min 3、DMEM-HG終止消化，離心，棄上清 4，加與胰酶同體積的0.1%的二型膠原酶，消化6min 5，DMEM-HG終止消化 6，靜置，待組織塊下沉，取出上清液，200目細(xì)胞篩過濾 7，濾液離心，棄上清 8，于沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液，裂解3min 9，DMEM-HG終止裂解，離心，棄上清 10，加DMEM-HG重懸，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)約達(dá)到7次方個(gè) 11,96孔板鋪板，每孔200uL，5*104個(gè)/孔 12，孵育12h后細(xì)胞貼壁良好，加5mg/ml MTT 20ul/孔 作用4h 13，棄上清，加150ul/孔 DMSO，振蕩10min 14，使用490nm讀數(shù)。 問題是，加入MTT作用4h以后，沒有形成藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶，顯微鏡下看，只有及少數(shù)細(xì)胞內(nèi)形成了結(jié)晶，讀數(shù)也只是0.1~0.3之間。 我考慮到的幾點(diǎn)原因是： 1，細(xì)胞濃度太小。因?yàn)槲易稍冞^做脾細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)的，說是把細(xì)胞濃度調(diào)到了6次方/孔 2，細(xì)胞活力不好�？墒菑馁N壁性能來看，細(xì)胞活力應(yīng)該也不會(huì)太差 3，細(xì)胞太雜，分離出來的時(shí)候明顯有枯否細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等 不知道有沒有人做過相關(guān)實(shí)驗(yàn)，可以交流或指導(dǎo)  |
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富蘭克林林
新蟲 (小有名氣)
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2樓2015-10-29 11:49:07
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