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[交流]
求各位前輩幫幫忙吧，快瘋了。。。 已有9人參與
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我做的是真菌基因組ＤＮＡ提取，做了好久，電泳才好歹有了個結(jié)果（圖１最右邊一個），ｍａｒｋｅｒ用的Ｄ２０００，也不知道這是不是ＤＮＡ。然后又做ＰＣＲ，就是做不出東西，ＰＣＲ的原材料都是去年老師買的，學(xué)姐用過的，據(jù)說什么都沒做出來。 ＰＣＲ總體系為５０微，包括 10×擴(kuò)增緩沖液 ５ul • dNTP混合物 �。眜l • 引物 （１００ｕＭ） 各２ul • 模板DNA １．５ul • Taq DNA聚合酶 （５Ｕ／ul） �。埃磚l • ２５ｍＭ Mg2+ ３ul • 加雙蒸水至 �。担皍l 反應(yīng)程序如下：９４℃�。常恚椋�， �。梗础妗。保恚椋睿� 起始退火溫度４８℃�。保恚椋�， �。罚病妗。常恚椋�， �。常皞�循環(huán)后７２℃�。保埃恚椋�， 模板用的圖１最右邊的樣品，引物是ＮＳ１和ＮＳ８，因?yàn)橛?jì)算這兩個引物ＴＭ值相差比較大，一個４９℃，一個５９℃，相差有１０度，所以每循環(huán)退火溫度升高０．４℃（這是叫ｔｏｕｃｈ－ｄｏｗｎ�。校茫覇�？），結(jié)果就做出了圖２的樣子，全是引物二聚體了？ｍａｒｋｅｒ用的Ｄ２０００。 我只有六個金幣，跪求各位前輩幫幫忙啊，小弟感激不盡�。。� 圖１.JPG 圖２.jpg |
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4樓2015-05-26 08:41:17
xueyuxx
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6樓2015-05-26 10:12:37
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7樓2015-05-26 10:35:05
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2015-05-26 23:03:00
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2015-05-26 23:03:00
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根據(jù)marker看膠是否有問題，marker的條帶都不是很清楚，膠的質(zhì)量需要改正，還有膠濃度多少？ 此外，擴(kuò)增沒有得到目的條帶而且引物二聚體嚴(yán)重，首先判斷模板沒有降解，其次引物設(shè)計(jì)的合理性需要驗(yàn)證，提高PCR擴(kuò)增的特異性方法有很多，建議換試劑已經(jīng)一年了，基本上酶啊buffer啊保質(zhì)期都是一年的，可以使用特異性高的酶擴(kuò)增 熱啟動酶，能夠避免引物二聚體和其他的非特異性條帶  |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
8樓2015-05-26 11:27:11
9樓2015-05-27 14:29:26
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10樓2015-05-27 15:04:12
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