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mu_mao新蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助WB中SDS電泳(總有一個(gè)泳道跑偏）和轉(zhuǎn)膜（電壓升不上去）的問題
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初學(xué)Western，已經(jīng)做了兩個(gè)月了，最開始的三次做的還行，不過上樣量不好，第四次開始就死活做不好了。 起初是只有內(nèi)參條帶，其余的一概曝不出，陸陸續(xù)續(xù)的，能換的都換了。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)可能是轉(zhuǎn)膜出了問題。 最新的一次做出來的結(jié)果如下 這是兩張膜的結(jié)果，最寬亮的是內(nèi)參GAPDH，內(nèi)參上方應(yīng)該有個(gè)目的條帶65k，沒爆出來 內(nèi)參下方23k的目的條帶，下面的那張膜爆出來了，但是顏色很淺，需要曝光5分鐘左右才能看到。 兩張膜對應(yīng)的第四泳道均出現(xiàn)了問題，導(dǎo)致內(nèi)參下移，23k的目的條帶第四泳道直接看不到了。 我用的是濕轉(zhuǎn)法 目前發(fā)現(xiàn)的問題是，電泳時(shí)候，有時(shí)候是左邊起第四泳道，有時(shí)候是右邊起第四泳道，溴酚藍(lán)跑的偏快一點(diǎn)點(diǎn)。 轉(zhuǎn)膜時(shí)候，看網(wǎng)上資料有人限流300mA，此時(shí)我的電壓只有85v左右。 我調(diào)到最大電流400mA時(shí)，電壓也只有95v，隨著轉(zhuǎn)膜時(shí)間增加，電流太大，放熱大，冰浴效果跟不上，電壓會降到75v。 根本達(dá)不到網(wǎng)上說的100~120v 之前轉(zhuǎn)1~2小時(shí)，只有內(nèi)參有條帶，現(xiàn)在轉(zhuǎn)4個(gè)小時(shí)，23k的條帶曝光5分鐘可見，但是65k的，一直看不到。 抗體肯定沒問題，第一次做的時(shí)候，300mA轉(zhuǎn)了1小時(shí)，23k，65k，都看到了�，F(xiàn)在死活重復(fù)不出來了。。。已經(jīng)快兩個(gè)月了 求有經(jīng)驗(yàn)的同學(xué)指點(diǎn)迷津 |
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mu_mao
新蟲 (小有名氣)
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- 專業(yè): 微生物藥物
2樓2015-05-26 16:41:23
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