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詳解你不了解的泛素化，有圖有實例哦�。。。� 已有5人參與
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蛋白質(zhì)翻譯后修飾在生命體中具有十分重要的作用，它使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，功能更為完善，調(diào)節(jié)更為精細(xì)，作用更為轉(zhuǎn)移。常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程有泛素化、磷酸化、乙�；⑻腔�，同時還有一些特殊的翻譯后修飾如甲基化、巴豆酰化、戊二酰化，丙二�；�，琥珀酰化等在生物過程中起到重要的作用。 而今天小編想和大家共享的是關(guān)于泛素化研究，一直以來，人們都忽視了蛋白質(zhì)水解酶參與細(xì)胞功能的調(diào)控，泛素和與其相關(guān)的蛋白水解酶的發(fā)現(xiàn)，給整個科學(xué)界帶來了**性的影響。泛素由76個氨基酸組成，高度保守，普遍存在于真核細(xì)胞內(nèi)，故名泛素。泛素化是可逆的，依賴ATP并且通過泛素激活酶E1，泛素結(jié)合酶E2，泛素連接酶E3一系列催化反應(yīng)所致。 具體過程為首先在ATP(紅色所示)供能的情況下酶E1(蛋白質(zhì)編號1r4n)粘附在泛素分子尾部(淡黃色所示)的Cys殘基上(綠色所示,注意在這個結(jié)構(gòu)中,Cys突變?yōu)锳la)激活泛素,接著,E1將激活的泛素分子轉(zhuǎn)移到E2酶上(蛋白質(zhì)編號1fxt),隨后,E2酶和一些種類不同的E3酶共同識別靶蛋白,對其進(jìn)行泛素化修飾。根據(jù)E3與靶蛋白的相對比例可以將靶蛋白單泛素化修飾和多聚泛素化修飾。E3酶(蛋白質(zhì)編號1ldk和1fqv)的外形就像一個夾子,靶蛋白連接在中間的空隙內(nèi)(星號所示)。酶的左側(cè)結(jié)構(gòu)域決定靶蛋白的特異性識別,右側(cè)結(jié)構(gòu)域定位E2酶以轉(zhuǎn)移泛素分子。 泛素化可以生產(chǎn)出單泛素化或多泛素化蛋白質(zhì)。后者在當(dāng)7個賴氨酸殘基的泛素與另一個泛素的甘氨酸C端連接形成。這種泛素分子鏈接在生物過程中起到重要的作用。共價結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶識別并降解，這是細(xì)胞內(nèi)短壽命蛋白質(zhì)和一些異常蛋白降解的普遍途徑。泛素化及類泛素化蛋白在細(xì)胞分裂，自噬，DNA修復(fù)，免疫應(yīng)答，細(xì)胞消亡等方面同樣起到關(guān)鍵作用。與消化道內(nèi)進(jìn)行的蛋白質(zhì)水解不同，從泛素與蛋白的結(jié)合到將蛋白水解成小的肽段，整個水解過程需要能量參與。人們開始意識到泛素-蛋白酶系統(tǒng)是一個對于真核細(xì)胞非常重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。 1、泛素化實驗方案 （1）利用可以純化泛素化底物的抗體（PTM-1101）富集并利用高通量質(zhì)譜檢測，該方案具有高靈敏度及高特異性。 （2）His-taggedubiquitin:該方案具有高特異性，但在有些生物樣本中面臨挑戰(zhàn)，如動物組織及臨床樣本。因為泛素化發(fā)生在個體分子中不同位點不同水平上，往往會導(dǎo)致富集出的蛋白在酶解后產(chǎn)生大量非修飾肽段影響結(jié)果鑒定。 2、泛素化研究挑戰(zhàn)和解決方案 1）挑戰(zhàn) 運用質(zhì)譜檢測泛素化會發(fā)生很多假陽性結(jié)果，所以在實驗中需要非常小心的驗證。雖然泛素化質(zhì)量偏移114.043 Da在質(zhì)譜中可以精確檢測出，但是還有其他的一些情況也會導(dǎo)致114Da的質(zhì)量偏移結(jié)果干擾鑒定結(jié)果。具體狀況如下。 （1） 天冬酰胺但單同位素殘基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為114.043Da； （2） 在蛋白酶解過程中普遍運用碘乙酰胺（IAM）對肽段進(jìn)行碘乙酰化反應(yīng)，而此時半胱氨酸及賴氨酸（有時）上會發(fā)生碘乙�；揎椩黾�57.021Da分子量； （3） 其他氨基酸影響，亮氨酸與異亮氨酸單同位素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為113.084Da以及他們m+1同位素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為114 Da。 2）解決方案 （1）改變烷基化試劑或者調(diào)整烷基化孵化溫度； （2）設(shè)置更高的質(zhì)量準(zhǔn)確度閾值及手動或軟件驗證的單一同位素質(zhì)量。 3、實例分享 Scientific Reports: SAHA在蛋白質(zhì)組、泛素化組及乙�；M中的神奇關(guān)聯(lián) 來自安徽省立醫(yī)院，安徽醫(yī)科大學(xué)及杭州景杰生物科技有限公司的研究人員在SAHA（SuberoylanilideHydroxamic Acid）治療非小細(xì)胞肺癌（A549Cell Line)機(jī)制研究中取得重大突破，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過SAHA刺激治療后的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系在蛋白質(zhì)組，泛素化修飾組及乙�；揎椊M之間有著密切的crosstalk。本研究內(nèi)容發(fā)表在2015年3月31日的ScientificReports雜志上。 組蛋白去乙�；福℉DACs）作為重要的癌癥診斷標(biāo)志物被人們熟知，而SAHA作為組蛋白去乙�；敢种苿⿲TCL（cutaneousT-cell lymphomas）癌癥診療試劑首個被FDA認(rèn)證的。該藥對非小細(xì)胞肺癌,乳房癌以及子宮癌都有較好的療效。在之前的研究中已經(jīng)證實SAHA對癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)組及乙酰化修飾組有著明顯的影響，而是否還有別的修飾類型對其產(chǎn)生影響，修飾之間有無新的crosstalk還待深入研究。 在本研究中研究人員基于SILAC（stableisotope labeling by amino acids）標(biāo)記，PTM-Biolabs生產(chǎn)的抗體富集及高分辨率液相質(zhì)譜定量技術(shù)對SAHA處理前后的A549細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組，泛素化組及乙酰化組進(jìn)行分析。其中蛋白質(zhì)組共鑒定到4302個蛋白質(zhì)，其中2968個蛋白被定量。在生物學(xué)分析中上調(diào)蛋白大多集中在線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而下調(diào)的蛋白則集中在細(xì)胞核，染色質(zhì)，核糖體，剪接體混合物及轉(zhuǎn)錄抑制因子混合物中，這說明SAHA的治療抑制了細(xì)胞轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步通過該策略研究泛素化組，科學(xué)家們鑒定到613個蛋白質(zhì)，1067個泛素化位點，其中586個蛋白質(zhì)1012個泛素化位點被定量。而大多數(shù)泛素化修飾的蛋白都集中在細(xì)胞膜上，這說明泛素化在細(xì)胞膜上扮演了重要的角色。乙酰化組鑒定到551個蛋白質(zhì)，1124個乙�；稽c，其中542個蛋白質(zhì)1099個乙�；稽c被定量。同時在組蛋白層面鑒定到91個乙�；稽c，這是現(xiàn)在全球最大的SAHA處理A549細(xì)胞的乙�；M數(shù)據(jù)庫。而這些上調(diào)的乙�；鞍缀娃D(zhuǎn)錄有著很大的關(guān)聯(lián)。 通過對蛋白表達(dá)水平分析科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組與泛素化組呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，這也與泛素化導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解功能是相關(guān)的。而在對泛素化組與乙酰化組關(guān)聯(lián)性分析上科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)在SAHA治療后呈現(xiàn)正相關(guān)性。非組蛋白的乙�；头核鼗霓D(zhuǎn)錄因子可以通過轉(zhuǎn)錄組影響蛋白質(zhì)組水平，而組蛋白的乙�；赡芡ㄟ^表觀遺傳學(xué)影響蛋白質(zhì)組學(xué)水平。 該研究首次在SAHA治療非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)了泛素化修飾，并深度分析了該修飾生物學(xué)作用，讓蛋白質(zhì)翻譯后修飾與蛋白質(zhì)表達(dá)水平的相關(guān)性研究為今后該領(lǐng)域的研究起到了指導(dǎo)的作用。更為重要的是蛋白質(zhì)組，泛素化組及乙�；Mcrosstalk的研究對于擴(kuò)展我們對SAHA治療肺小細(xì)胞癌的治療有了更為深刻的了解，為后期對該領(lǐng)域的機(jī)制研究提供了方向。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubm ... d+Acetylome+in+Non- |
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2015-05-28 16:15:40, 2.62 M
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5樓2015-11-05 17:28:32
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