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[求助]
NCBI上序列確定和引物設計上的問題 已有2人參與
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小弟是做qpcr的，半路出家，以前一直是悶頭做，也沒太思考序列位置確定和引物設計問題，今天思考了一下，發(fā)現(xiàn)有好多問題折騰不清，特來寶地問問大神們，希望不吝賜教。 1. 針對于RNA樣本進行PCR試驗時，是不是我在構建模板的時候就用NCBI上查詢的cDNA序列或者mRNA學列設計即可； 2. 針對于DNA樣本進行PCR試驗時，理論上要求我要在保守區(qū)域設計引物，那么保守區(qū)域的確定方式是不是就是當我針對于序列設計完引物，然后BLAST，沒有相似度太高的同源序列即可； 3. 針對于模板構建，我想問的是如果精確定位目的基因位置的。譬如我想找的基因是PIK3CA的E542K也就是1624 G>A在exon 9上，這個1624是針對于那個定義說的，我能確定的是它肯定不是3號染色體整個序列上了，那么這個數(shù)字是針對于CDS說的還是mRNA說的，有文獻上給出NG_012113.1，可是我在exon 9上說啥也找不到我想要的那個SNP； 4. 最后一個問題還是引物設計問題，我是針對于DNA設計的試驗，所以肯定不會再mRNA上設計引物了，那么問題來了，我是在CDS上圍繞這個SNP設計啊，還是在3號染色體全序列上圍繞這個SNP設計。 |
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數(shù) +1
linzshit: 金幣+20, ★★★很有幫助 2015-06-03 08:47:45
感謝參與，應助指數(shù) +1
linzshit: 金幣+20, ★★★很有幫助 2015-06-03 08:47:45
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第一個問題：建議上下游引物夸至少一個內(nèi)含子，若區(qū)分靶基因不同剪接轉(zhuǎn)錄本，則應在靶轉(zhuǎn)錄本特有序列處設計。另外還要查下靶基因是否存在假基因，設計的時候盡量避免假基因； 第二個問題：做DNA的qPCR直接設計一組特異性好的引物即可，個人感覺沒有啥特殊位置要求。因為你特異性好的話已經(jīng)滿足你的要求了，沒必要找保守區(qū)了對吧~ 第三個問題：1624是指PIK3CA 9號外顯子上第1624位的SNP，是由G變成A。你只要在UCSC上輸入PIK3CA，他直接就給你在基因組里搜了，到時候你只要找到相應染色體上的位置就是了~ 最后一個問題：你用gDNA作為研究對象，那當然在gDNA上設計引物啦~如果你要定量這個SNP，那你上游引物或者下游引物的3’端最好搭在這個SNP上，或者你用5‘端搭在這個SNP上面的Taqman Probe，如果你要克隆或者做sanger測序，那就隨意多了。 以上僅供參考，希望能幫到你~ |
3樓2015-06-02 00:18:07
2樓2015-06-01 16:54:17
4樓2015-06-02 09:51:05
5樓2015-06-03 08:47:31
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