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NCBI上序列確定和引物設(shè)計(jì)上的問題 已有2人參與
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小弟是做qpcr的，半路出家，以前一直是悶頭做，也沒太思考序列位置確定和引物設(shè)計(jì)問題，今天思考了一下，發(fā)現(xiàn)有好多問題折騰不清，特來寶地問問大神們，希望不吝賜教。 1. 針對于RNA樣本進(jìn)行PCR試驗(yàn)時(shí)，是不是我在構(gòu)建模板的時(shí)候就用NCBI上查詢的cDNA序列或者mRNA學(xué)列設(shè)計(jì)即可； 2. 針對于DNA樣本進(jìn)行PCR試驗(yàn)時(shí)，理論上要求我要在保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，那么保守區(qū)域的確定方式是不是就是當(dāng)我針對于序列設(shè)計(jì)完引物，然后BLAST，沒有相似度太高的同源序列即可； 3. 針對于模板構(gòu)建，我想問的是如果精確定位目的基因位置的。譬如我想找的基因是PIK3CA的E542K也就是1624 G>A在exon 9上，這個(gè)1624是針對于那個(gè)定義說的，我能確定的是它肯定不是3號染色體整個(gè)序列上了，那么這個(gè)數(shù)字是針對于CDS說的還是mRNA說的，有文獻(xiàn)上給出NG_012113.1，可是我在exon 9上說啥也找不到我想要的那個(gè)SNP； 4. 最后一個(gè)問題還是引物設(shè)計(jì)問題，我是針對于DNA設(shè)計(jì)的試驗(yàn)，所以肯定不會再mRNA上設(shè)計(jì)引物了，那么問題來了，我是在CDS上圍繞這個(gè)SNP設(shè)計(jì)啊，還是在3號染色體全序列上圍繞這個(gè)SNP設(shè)計(jì)。 |
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4樓2015-06-02 09:51:05
2樓2015-06-01 16:54:17
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
linzshit: 金幣+20, ★★★很有幫助 2015-06-03 08:47:45
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
linzshit: 金幣+20, ★★★很有幫助 2015-06-03 08:47:45
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第一個(gè)問題：建議上下游引物夸至少一個(gè)內(nèi)含子，若區(qū)分靶基因不同剪接轉(zhuǎn)錄本，則應(yīng)在靶轉(zhuǎn)錄本特有序列處設(shè)計(jì)。另外還要查下靶基因是否存在假基因，設(shè)計(jì)的時(shí)候盡量避免假基因； 第二個(gè)問題：做DNA的qPCR直接設(shè)計(jì)一組特異性好的引物即可，個(gè)人感覺沒有啥特殊位置要求。因?yàn)槟闾禺愋院玫脑捯呀?jīng)滿足你的要求了，沒必要找保守區(qū)了對吧~ 第三個(gè)問題：1624是指PIK3CA 9號外顯子上第1624位的SNP，是由G變成A。你只要在UCSC上輸入PIK3CA，他直接就給你在基因組里搜了，到時(shí)候你只要找到相應(yīng)染色體上的位置就是了~ 最后一個(gè)問題：你用gDNA作為研究對象，那當(dāng)然在gDNA上設(shè)計(jì)引物啦~如果你要定量這個(gè)SNP，那你上游引物或者下游引物的3’端最好搭在這個(gè)SNP上，或者你用5‘端搭在這個(gè)SNP上面的Taqman Probe，如果你要克隆或者做sanger測序，那就隨意多了。 以上僅供參考，希望能幫到你~ |
3樓2015-06-02 00:18:07
5樓2015-06-03 08:47:31
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