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請(qǐng)問在做原核表達(dá)-蛋白純化時(shí)用到的裂解液是購買的還是自己配制的？ 已有1人參與
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請(qǐng)問在做原核表達(dá)-蛋白純化時(shí)用到的裂解液是購買的還是自己配制的？ 如果購買的商品化裂解液，是否還繼續(xù)用超聲裂解？ |
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惡魔的左眼
木蟲 (正式寫手)
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- 金幣: 2237.7
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- 專業(yè): 蛋白質(zhì)組學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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可以購買也可以自己配，我們就是自己配的，這樣比較好掌握一些。 細(xì)胞裂解液的成分包括了Tris-HCl、EDTA 和NaCl。組織裂解液的成分主要是 Urea、thiourea、CHAPS 等。除了表達(dá)蛋白的提取裂解液外，上述兩種裂解液在一些實(shí)驗(yàn)中的用途也不可小覷。本文介紹這兩種裂解液的配方和配制過程。 組織裂解液配方： 7M Urea(60. 06) 4.2042 g 2M thiourea(76.12) 1.5224 g 100mM DTT 0.1543 g 4% CHAPS 0.4 g 0.5mM EDTA 0.00146 g 40Mm Tris 0.0485 g 2%(v/v) NP-40 0.2 ml 1%(v/v) Triton X-100 0.1 ml 5mM PMSF用前加 0.00871 g 2%pharmalyte 0.2ml 共10ml分裝成400μl/每管(可應(yīng)用于30-80毫克組織裂解) 細(xì)胞裂解液配方： 6M Urea(60. 06) 1.8018 g 2M thiourea(76.12) 0. 7613 g 65mM DTT 0.050 g 4% CHAPS 0.2 g 40Mm Trisbase 0.02425 g 共5ml分裝成200μl/每管(可應(yīng)用于50-100ml培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞裂解) 1、溶液準(zhǔn)備 2×樣品緩沖液：130mM Tris-HCl ( pH8.0 ) , 20% ( v/v ) 甘油 , 4.6% ( w/v ) SDS , 0.02% 溴酚藍(lán) , 2% DTT PBS ( pH7.4 ) ：10mM Na2HPO4 , 1.8mM KH2PO4 , 50mM NaCl , 2.7mM KCl RIPA緩沖液：50mM Tris-HCl(pH7.4) , 150mM NaCl , 1mM EDTA , 1%Triton×100 , 1%去氧膽酸鈉 , 0.1%SDS , 1mM PMSF , 1μg/ml 牛胰蛋白酶抑制劑 ( aprotinin ) , 1μg/ml亮抑蛋白酶肽 ( leupeptin ) 裂解液緩沖液：10mM Tris-HCl(pH7.4) , 0.15M NaCl , 5mM EDTA(pH8.0) , 1%Triton×100;使用前加5mM DTT,0.1mM PMSF異丙醇和5mM ε-氨基己酸 2、裂解液的制備 制備細(xì)胞裂解液： 收集胰蛋白酶消化的細(xì)胞并離心，用PBS清洗。 用100μl RIPA緩沖液冰浴溶解沉淀10min(每500000個(gè)細(xì)胞20μl RIPA緩沖液)。 10000rpm，4℃離心10min，取上清轉(zhuǎn)移至新管。 用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。 用裂解緩沖液將溶液濃度調(diào)到5mg/ml，每小瓶中放100μl，-80℃儲(chǔ)存。 按照1：1體積比混合2×樣品緩沖液，煮沸5min后，室溫放置5min。 短時(shí)離心后點(diǎn)樣電泳檢測(cè)。 制備組織裂解液： 在制備過程中一直將溶胞液或組織放在冰上。 切開組織，稱取組織1.5g于PBS中清洗。 在RIPA緩沖液中剪碎組織后，轉(zhuǎn)移到勻漿器中，加足5ml RIPA緩沖液，研磨20min。 將研磨液轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，14000rpm，4℃離心10min。 取上清液作為完整的組織裂解液。 用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。 用裂解緩沖液將溶液濃度調(diào)到5mg/ml，每小瓶中放100μl，-80℃儲(chǔ)存。 按照1：1體積比混合2×樣品緩沖液，煮沸5min后，室溫放置5min。 短時(shí)離心后點(diǎn)樣電泳檢測(cè)。 需要注意的是，為了減少以及杜絕核酸降解，樣品被徹底勻漿之前的步驟需要多加留意。還有就是短時(shí)離心后點(diǎn)樣電泳檢測(cè)。讓樣品從脫離原來的生存環(huán)境的時(shí)間盡量縮短。 |
2樓2015-06-04 10:33:57
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