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蛋白原核表達和包涵體純化問題 已有2人參與
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大家好，最近在原核表達兩個蛋白，一個是153AA，一個是166AA，均有信號肽，用salI和NotI酶切位點克隆進PET28A載體中，30度誘導4h, 153AA的大表有表達，大概是20KD，表達量小，估計3%，166AA的大表沒有表達。 用含溶菌酶的裂解液裂解（沒有超聲裂解）后，發(fā)現(xiàn)二者主要都是包涵體表達，因為上清中很少蛋白，用8M尿素變性（變性時由于用的是1.5ml離心管做的小樣，沒有超聲處理，所以也是溶解一部分），之后取變性的樣品上清和沉淀SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)二者分子量一樣是14KD，很奇怪的現(xiàn)象,難道是提前終止了么？還是因為變性不充分，蛋白沒有完全展開，但是也不至于分子量是一樣，并且偏小這么多吧？大家遇到過這樣的問題么？謝謝！ 對于這個現(xiàn)象，把誘導前的菌做了PCR鑒定，相互之間是沒有污染的，并且166AA的克隆是送測序過的，所以克隆構(gòu)建也沒有問題。 |
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 蛋白表達純化與檢測 |
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2樓2014-08-05 10:07:24
凌波麗
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【答案】應助回帖
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zbblpp: 金幣+5, ★★★很有幫助, 謝謝 2014-08-06 15:40:06
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| 給你個包涵體純化、變性和復性的實驗流程吧，具體你的問題改日再討論，今天我沒有時間了。 |
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2014-08-05 10:38:08, 93.73 K
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salanero2000
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8樓2014-08-07 09:57:11
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謝謝您！后續(xù)驗證想根據(jù)功能，是否有活性。目前看情況，感覺有活性的幾率比較小。 下面是我整理了一張圖片處理，這次的尿素溶解溶解的不好，但是也可以看到分子量，我在后續(xù)的實驗中分子量均如此。不過今天我處理圖片時，發(fā)現(xiàn)從這張圖片看，蛋白2（166AA）的包涵體分子量好像略大那么一點點，但也在14附近，應該也有可能像您說的PAGE表觀與預期分子量不符是常有的事情。 蛋白1（153AA）預測分子量是17，加上載體上的序列，20KD差不多。 蛋白1（133AA，不含信號肽），預測是15.5KD，加上載體序列差不多18. 蛋白2（166AA），預測是19.3KD，加上載體上的序列差不多應該22.這個與包涵體相差較大。 另外，最近看文獻，發(fā)現(xiàn)有文獻提到蛋白2在重組表達時可能會出現(xiàn)C端氨基酸丟失的現(xiàn)象。 細菌裂解后尿素變性跑膠---.jpg |
9樓2014-08-07 10:52:57
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