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蛋白原核表達(dá)和包涵體純化問(wèn)題 已有2人參與
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大家好，最近在原核表達(dá)兩個(gè)蛋白，一個(gè)是153AA，一個(gè)是166AA，均有信號(hào)肽，用salI和NotI酶切位點(diǎn)克隆進(jìn)PET28A載體中，30度誘導(dǎo)4h, 153AA的大表有表達(dá)，大概是20KD，表達(dá)量小，估計(jì)3%，166AA的大表沒(méi)有表達(dá)。 用含溶菌酶的裂解液裂解（沒(méi)有超聲裂解）后，發(fā)現(xiàn)二者主要都是包涵體表達(dá)，因?yàn)樯锨逯泻苌俚鞍祝?M尿素變性（變性時(shí)由于用的是1.5ml離心管做的小樣，沒(méi)有超聲處理，所以也是溶解一部分），之后取變性的樣品上清和沉淀SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)二者分子量一樣是14KD，很奇怪的現(xiàn)象,難道是提前終止了么？還是因?yàn)樽冃圆怀浞郑鞍讻](méi)有完全展開(kāi)，但是也不至于分子量是一樣，并且偏小這么多吧？大家遇到過(guò)這樣的問(wèn)題么？謝謝！ 對(duì)于這個(gè)現(xiàn)象，把誘導(dǎo)前的菌做了PCR鑒定，相互之間是沒(méi)有污染的，并且166AA的克隆是送測(cè)序過(guò)的，所以克隆構(gòu)建也沒(méi)有問(wèn)題。 |
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 蛋白表達(dá)純化與檢測(cè) |
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謝謝您！后續(xù)驗(yàn)證想根據(jù)功能，是否有活性。目前看情況，感覺(jué)有活性的幾率比較小。 下面是我整理了一張圖片處理，這次的尿素溶解溶解的不好，但是也可以看到分子量，我在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中分子量均如此。不過(guò)今天我處理圖片時(shí)，發(fā)現(xiàn)從這張圖片看，蛋白2（166AA）的包涵體分子量好像略大那么一點(diǎn)點(diǎn)，但也在14附近，應(yīng)該也有可能像您說(shuō)的PAGE表觀與預(yù)期分子量不符是常有的事情。 蛋白1（153AA）預(yù)測(cè)分子量是17，加上載體上的序列，20KD差不多。 蛋白1（133AA，不含信號(hào)肽），預(yù)測(cè)是15.5KD，加上載體序列差不多18. 蛋白2（166AA），預(yù)測(cè)是19.3KD，加上載體上的序列差不多應(yīng)該22.這個(gè)與包涵體相差較大。 另外，最近看文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)有文獻(xiàn)提到蛋白2在重組表達(dá)時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)C端氨基酸丟失的現(xiàn)象。 細(xì)菌裂解后尿素變性跑膠---.jpg |
9樓2014-08-07 10:52:57
2樓2014-08-05 10:07:24
凌波麗
專家顧問(wèn) (知名作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
youlinglyw: 金幣+3, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，生物科學(xué)有你更精彩！ 2014-08-06 09:06:10
zbblpp: 金幣+5, ★★★很有幫助, 謝謝 2014-08-06 15:40:06
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| 給你個(gè)包涵體純化、變性和復(fù)性的實(shí)驗(yàn)流程吧，具體你的問(wèn)題改日再討論，今天我沒(méi)有時(shí)間了。 |
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2014-08-05 10:38:08, 93.73 K
3樓2014-08-05 10:31:03
4樓2014-08-05 16:18:52
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