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[求助]
蛋白原核表達(dá)和包涵體純化問題 已有2人參與
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大家好，最近在原核表達(dá)兩個(gè)蛋白，一個(gè)是153AA，一個(gè)是166AA，均有信號肽，用salI和NotI酶切位點(diǎn)克隆進(jìn)PET28A載體中，30度誘導(dǎo)4h, 153AA的大表有表達(dá)，大概是20KD，表達(dá)量小，估計(jì)3%，166AA的大表沒有表達(dá)。 用含溶菌酶的裂解液裂解（沒有超聲裂解）后，發(fā)現(xiàn)二者主要都是包涵體表達(dá)，因?yàn)樯锨逯泻苌俚鞍�，�?M尿素變性（變性時(shí)由于用的是1.5ml離心管做的小樣，沒有超聲處理，所以也是溶解一部分），之后取變性的樣品上清和沉淀SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)二者分子量一樣是14KD，很奇怪的現(xiàn)象,難道是提前終止了么？還是因?yàn)樽冃圆怀浞�，蛋白沒有完全展開，但是也不至于分子量是一樣，并且偏小這么多吧？大家遇到過這樣的問題么？謝謝！ 對于這個(gè)現(xiàn)象，把誘導(dǎo)前的菌做了PCR鑒定，相互之間是沒有污染的，并且166AA的克隆是送測序過的，所以克隆構(gòu)建也沒有問題。 |
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 蛋白表達(dá)純化與檢測 |
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4樓2014-08-05 16:18:52
2樓2014-08-05 10:07:24
凌波麗
專家顧問 (知名作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
youlinglyw: 金幣+3, 贈人玫瑰手有余香，生物科學(xué)有你更精彩！ 2014-08-06 09:06:10
zbblpp: 金幣+5, ★★★很有幫助, 謝謝 2014-08-06 15:40:06
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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| 給你個(gè)包涵體純化、變性和復(fù)性的實(shí)驗(yàn)流程吧，具體你的問題改日再討論，今天我沒有時(shí)間了。 |
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2014-08-05 10:38:08, 93.73 K
3樓2014-08-05 10:31:03
5樓2014-08-06 15:41:09
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