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drh34銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
BiFC只能驗(yàn)證蛋白的直接互作嗎 已有2人參與
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| BiFC實(shí)驗(yàn)結(jié)果兩個(gè)蛋白有互作，但酵母雙雜交不互作，求解！？ |
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鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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3樓2015-06-10 19:08:59
starseacow
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2015-06-10 16:25:15
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2015-06-10 16:25:15
| 做蛋白相互作用有很多方法，任何一個(gè)都有其優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)，同時(shí)也可能造成假陽(yáng)性或無(wú)法測(cè)到某些相互作用，BiFC實(shí)際上反應(yīng)了生理?xiàng)l件下一對(duì)蛋白能否接近到很近的狀態(tài)，由此驗(yàn)證是否有相互作用存在。樓主的問(wèn)題給出信息偏少，不好判斷。可能是BiFC結(jié)果有問(wèn)題，實(shí)際上不存在相互作用，也可能是酵母那邊蛋白表達(dá)或構(gòu)象不正確，無(wú)法測(cè)出相互作用，這種情況下需要一方面分析實(shí)驗(yàn)看看有沒(méi)有問(wèn)題，另一方面是換用別的方法譬如pull down。 |
2樓2015-06-10 15:52:37
calorimetry
銅蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 51 (初中生)
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- 專(zhuān)業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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BiFC陽(yáng)性能夠說(shuō)明說(shuō)明是兩個(gè)蛋白直接互作！ 雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)BiFC（Bimolecular Fluorescence Complementation） 是將熒光報(bào)告蛋白按照規(guī)則分成沒(méi)有熒光的兩段，分別與誘餌蛋白和捕獲蛋白融合，只有在誘餌蛋白和捕獲蛋白發(fā)生相互作用的情況下，兩段不完整的熒光報(bào)告蛋白才會(huì)形成完整的報(bào)告蛋白，發(fā)出熒光�；罴�(xì)胞收集后，在流式細(xì)胞儀中的檢測(cè)是實(shí)時(shí)進(jìn)行的，只要細(xì)胞中有熒光產(chǎn)生就會(huì)被捕捉到信號(hào)，因此，不論是親和力較弱的結(jié)合還是暫時(shí)性的結(jié)合都不會(huì)被遺漏。 這是一種比較新型的蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)技術(shù)，理論上講，可能在一些時(shí)候可以比酵母雙雜交更靈敏，但是無(wú)論是雙分子熒光還是酵母雙雜交，都涉及到一個(gè)融合蛋白的構(gòu)像改變的問(wèn)題，如果與熒光報(bào)道基因的兩個(gè)分割部分或者轉(zhuǎn)錄因子的兩個(gè)分割部分中兩者或者另種實(shí)驗(yàn)方法中的報(bào)告蛋白質(zhì)的兩部分任何之一發(fā)生劇烈的構(gòu)想變化，那么可能能夠相互作用的被檢測(cè)的兩種蛋白質(zhì)的標(biāo)記者卻無(wú)法形成有功能的報(bào)告蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，那么實(shí)驗(yàn)結(jié)果就無(wú)法顯示出陽(yáng)性。而蛋白質(zhì)的折疊是一種很復(fù)雜的過(guò)程，沒(méi)有任何一種理論能夠概括出所有已知的蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程和折疊結(jié)果，而且有些蛋白質(zhì)也不是只有一種折疊路徑，甚至不止一種穩(wěn)定的折疊結(jié)果。 所以樓主因該多用一些蛋白質(zhì)相互作用的研究方法，具體研究方法請(qǐng)見(jiàn)： Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions,Humana Press,2004（唯一完整版） http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=7764403 此書(shū)是我在米國(guó)的師姐發(fā)的。 |
4樓2015-06-12 15:53:25
calorimetry
銅蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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5樓2015-06-12 15:54:21
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