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drh34銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
BiFC只能驗證蛋白的直接互作嗎 已有2人參與
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| BiFC實驗結(jié)果兩個蛋白有互作，但酵母雙雜交不互作，求解��？ |
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calorimetry
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【答案】應(yīng)助回帖
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BiFC陽性能夠說明說明是兩個蛋白直接互作！ 雙分子熒光互補技術(shù)BiFC（Bimolecular Fluorescence Complementation） 是將熒光報告蛋白按照規(guī)則分成沒有熒光的兩段，分別與誘餌蛋白和捕獲蛋白融合，只有在誘餌蛋白和捕獲蛋白發(fā)生相互作用的情況下，兩段不完整的熒光報告蛋白才會形成完整的報告蛋白，發(fā)出熒光�；罴毎占螅诹魇郊毎麅x中的檢測是實時進行的，只要細胞中有熒光產(chǎn)生就會被捕捉到信號，因此，不論是親和力較弱的結(jié)合還是暫時性的結(jié)合都不會被遺漏。 這是一種比較新型的蛋白質(zhì)相互作用檢測技術(shù)，理論上講，可能在一些時候可以比酵母雙雜交更靈敏，但是無論是雙分子熒光還是酵母雙雜交，都涉及到一個融合蛋白的構(gòu)像改變的問題，如果與熒光報道基因的兩個分割部分或者轉(zhuǎn)錄因子的兩個分割部分中兩者或者另種實驗方法中的報告蛋白質(zhì)的兩部分任何之一發(fā)生劇烈的構(gòu)想變化，那么可能能夠相互作用的被檢測的兩種蛋白質(zhì)的標記者卻無法形成有功能的報告蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，那么實驗結(jié)果就無法顯示出陽性。而蛋白質(zhì)的折疊是一種很復(fù)雜的過程，沒有任何一種理論能夠概括出所有已知的蛋白質(zhì)的折疊過程和折疊結(jié)果，而且有些蛋白質(zhì)也不是只有一種折疊路徑，甚至不止一種穩(wěn)定的折疊結(jié)果。 所以樓主因該多用一些蛋白質(zhì)相互作用的研究方法，具體研究方法請見： Haian Fu edits ,Protein-Protein Interactions,Humana Press,2004（唯一完整版） http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=7764403 此書是我在米國的師姐發(fā)的。 |
4樓2015-06-12 15:53:25
starseacow
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+2, 鼓勵交流 2015-06-10 16:25:15
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kx444555: 金幣+2, 鼓勵交流 2015-06-10 16:25:15
| 做蛋白相互作用有很多方法，任何一個都有其優(yōu)點缺點，同時也可能造成假陽性或無法測到某些相互作用，BiFC實際上反應(yīng)了生理條件下一對蛋白能否接近到很近的狀態(tài)，由此驗證是否有相互作用存在。樓主的問題給出信息偏少，不好判斷�？赡苁荁iFC結(jié)果有問題，實際上不存在相互作用，也可能是酵母那邊蛋白表達或構(gòu)象不正確，無法測出相互作用，這種情況下需要一方面分析實驗看看有沒有問題，另一方面是換用別的方法譬如pull down。 |
2樓2015-06-10 15:52:37
MrFat
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3樓2015-06-10 19:08:59
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5樓2015-06-12 15:54:21
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