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His-Tag純化遇到的問題 已有3人參與
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最近開始做蛋白的純化，希望能拿到高純度的酶，蛋白是可溶性表達(dá)，所以直接拿上清液做的Ni柱純化，可是發(fā)現(xiàn)不掛住，標(biāo)簽是在N端，推測(cè)是His標(biāo)簽被包裹了，所以用8M尿素溶解，變成線性之后又做了純化，發(fā)現(xiàn)可以純化出來了，驗(yàn)證了我的推測(cè)。但是我要的是可溶性表達(dá)，我該怎么解決His標(biāo)簽被包含的問題呢？不能做復(fù)性，我要的量比較大，需要可溶性表達(dá)。 我查資料發(fā)現(xiàn)可以加自己設(shè)計(jì)加His的長(zhǎng)度，如果有誰知道方法的話交流一下。我的質(zhì)粒C端沒有His標(biāo)簽，如果要加只能手動(dòng)加，但是不知道怎么設(shè)計(jì)引物，因?yàn)樵诿盖形稽c(diǎn)之后了~ |
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3樓2015-07-14 17:52:40
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2樓2015-07-14 17:05:08
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- 專業(yè): 核技術(shù)及其應(yīng)用
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4樓2015-08-25 11:37:18
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PET28a BL21 第一次構(gòu)建時(shí)只留了一個(gè)標(biāo)簽 沒有去除C端的終止密碼子 又構(gòu)建了一次 去掉終止密碼子 又加了個(gè)標(biāo)簽 按說兩個(gè)標(biāo)簽應(yīng)該結(jié)合更牢固 （上清）純化后目的蛋白還是沒結(jié)合上 有的雜蛋白結(jié)合上了 我這個(gè)蛋白包涵體表達(dá)量很高 之前做過切膠純化免疫小鼠 上清中也有目的蛋白 就是量少 怕后期做ELISA時(shí) 因?yàn)榘w的緣故出現(xiàn)差錯(cuò) 想換成可溶性表達(dá)的 看到論壇中有的是加9個(gè)his標(biāo)簽 有沒有大神支支招 |
5樓2016-09-08 09:42:08
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