 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 2889 | 回復: 18 | ||||
star97lx新蟲 (小有名氣)
|
[交流]
關(guān)于western blot轉(zhuǎn)膜，請教大神
|
|||
| 小女子最近開始做western blot實驗以求畢業(yè)，跑page顯示的是有蛋白，但是轉(zhuǎn)膜曝光之后一直沒有條帶，轉(zhuǎn)膜后看得到marker，馬上用麗春紅染，也看不到蛋白，用考馬斯亮藍染剩下的膠，發(fā)現(xiàn)上面還剩下的是小分子蛋白。求助一下大神這是什么情況：為什么小分子的蛋白還留在膠上面？膜上一直檢測不到蛋白？跪謝，不勝感激�。。。� |
回復此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 蛋白質(zhì)生物學實驗經(jīng)驗 |
» 猜你喜歡
346求調(diào)劑[0856]
已經(jīng)有7人回復
-
一志愿山大07化學 332分 四六級已過 本科山東雙非 求調(diào)劑！
已經(jīng)有3人回復
-
310求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復
-
機械專碩299求調(diào)劑至材料
已經(jīng)有4人回復
-
070300化學319求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復
-
08工科 320總分 求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復
-
一志愿天津大學化學工藝專業(yè)（081702）315分求調(diào)劑
已經(jīng)有12人回復
-
307求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復
-
265求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復
-
301求調(diào)劑
已經(jīng)有10人回復
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 關(guān)于western blot
已經(jīng)有2人回復
- 關(guān)于western轉(zhuǎn)膜
已經(jīng)有4人回復
- 關(guān)于western blotting
已經(jīng)有1人回復
- 關(guān)于western blot背景太深
已經(jīng)有5人回復
- 關(guān)于Western最后一步X光片顯影定影
已經(jīng)有3人回復
- 求助關(guān)于Western blot.
已經(jīng)有8人回復
- 關(guān)于western的顯影問題
已經(jīng)有10人回復
- 關(guān)于western blot
已經(jīng)有4人回復
- 關(guān)于western曝光方法求助
已經(jīng)有2人回復
- 關(guān)于western blot 試驗
已經(jīng)有2人回復
- 關(guān)于western blot樣品制備
已經(jīng)有8人回復
- 關(guān)于western blot
已經(jīng)有4人回復
- 關(guān)于western blot的小問題
已經(jīng)有12人回復
- 關(guān)于western blotting
已經(jīng)有1人回復
- 關(guān)于Western Union transfer
已經(jīng)有6人回復
- 關(guān)于Western抗體選擇
已經(jīng)有1人回復
- 關(guān)于western blotting MARKER 的問題
已經(jīng)有12人回復
- 關(guān)于western上樣
已經(jīng)有17人回復
- 關(guān)于western blot的一兩個實驗疑問。
已經(jīng)有6人回復
- 關(guān)于western blot顯影液
已經(jīng)有9人回復
- 關(guān)于western blot轉(zhuǎn)膜
已經(jīng)有20人回復
凌波麗
專家顧問 (知名作家)
-
專家經(jīng)驗: +218 - BioEPI: 11
- 應助: 397 (碩士)
- 貴賓: 0.044
- 金幣: 2118.9
- 散金: 10
- 紅花: 208
- 帖子: 5633
- 在線: 571.6小時
- 蟲號: 1766465
- 注冊: 2012-04-19
- 性別: MM
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
- 管轄: 生物科學綜合
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
|
WB出現(xiàn)非特異性條帶的原因與解決方法 凌波麗 2015年7月16日 1.抗體濃度過高；降低一抗、二抗的濃度，可以分梯度進行。 2.一抗的特異性不足；使用單克隆抗體，單克隆位點的抗原表位是唯一的，多克隆位點的表位不唯一。 3.二抗的非特異性結(jié)合，不加一抗，其他操作不變，即可檢測出二抗的非特異性的條帶是否來自二抗的非特異性結(jié)合；此時需要重新選擇二抗。 4.樣品蛋白質(zhì)上樣量過大；降低上樣量，可以分梯度進行。 5.樣品蛋白質(zhì)發(fā)生了降解，降解產(chǎn)物成為了一抗或二抗的新的抗原，尤其是在一抗或二抗不是單克隆抗體時更為明顯；避免對樣品蛋白質(zhì)反復凍融，食用新鮮的蛋白質(zhì)樣品，可以使用蛋白酶的廣譜抑制劑（已經(jīng)有商用產(chǎn)品），必要的話使用分子篩層析或HPLC純化蛋白質(zhì)樣品后再上樣（HPLC不能用于蛋白質(zhì)制備，不過用做WB的量還是能夠提供的）。 6.細胞傳代過多，導致蛋白質(zhì)變異。使用傳代次數(shù)少的細胞的表達的蛋白質(zhì)進行對比，并且作為分子篩層析或HPLC的純化標準，分子篩層析或HPLC能夠分離出構(gòu)象差異的同分異構(gòu)體。可以在上樣前，用紅外、紫外光譜檢測一下，并且對比標準品的數(shù)據(jù)。 7.因為WB的一抗識別的蛋白質(zhì)的表位是順序表位，不是空間表位，所以WB狀態(tài)下的抗原-抗體識別，與非變性的生理條件下的抗原-抗體識別不同。 8.WB之前，先用分子篩純化同時也是檢測一下目的蛋白產(chǎn)物是否成功。也就是目的蛋白是否成功表達了，而且在提取后穩(wěn)定存在了。 9.非特異性的條帶分子量出現(xiàn)可能是SDS PAGE出的問題，膠的濃度不合適或者樣品溶解度不夠或者電泳時間不合適等，造成了目的條帶的表觀質(zhì)量變化。但是如果最終帶與目的蛋白質(zhì)的分子量差距非常大，那么就不是SDSPAGE電泳引起的蛋白質(zhì)的表觀分子量變化的問題了。 10.多個非特異性的分子量不同的帶出現(xiàn)可能是目的蛋白在SDS PAGE電泳出的問題出了問題，也可能本來就是雜帶了�？梢曰厥蘸髮Ω鳁l帶用質(zhì)譜檢測精確的分子量加以確定。 11.多個非特異性的分子量不同的條帶至少應該有雜帶，雜帶出現(xiàn)而且與一抗相互作用，那么只能說雜帶的順序表位也能被一抗識別，必須更換專一性更高的抗體。 12.使是線性表位在“變性蛋白質(zhì)抗原”的折疊態(tài)中也可能會產(chǎn)生空間位阻的問題： （1）因為“變性蛋白質(zhì)抗原”中的線性表位的空間位阻可能不同于“復性蛋白質(zhì)抗原”的線性表位的空間位阻，這樣“變性蛋白質(zhì)抗原”的線性表位產(chǎn)生的抗體，使得“復性蛋白質(zhì)抗原”-“變性蛋白質(zhì)的抗體”彼此根本接近不了，而使“變性蛋白質(zhì)的抗體”無法識別“復性蛋白質(zhì)”的線性表位； （2）可能“變性蛋白質(zhì)的抗體”能夠識別“復性蛋白質(zhì)”的線性表位，但是由于“變性蛋白質(zhì)”的抗體與“復性蛋白質(zhì)”的相互作用時由于位阻而導致“變性蛋白質(zhì)”的抗體與“復性蛋白質(zhì)”的接觸面無法發(fā)生有效的空間形狀的變形契合以及使兩者的接觸面無法發(fā)生電荷有效的互補，從而使得抗原-抗體反應不能有效發(fā)生，沒有具體檢測不可以排除這種可能性； 另外一個問題：變性蛋白質(zhì)的抗原的不同于復性蛋白質(zhì)抗原的折疊態(tài)，未必不會使變性蛋白質(zhì)的抗原有新的線性表位或空間表位形成，變性蛋白質(zhì)的抗原產(chǎn)生的抗體可就復雜了。 上面說的比較拗口，不知道各位能否看明白，總之，加入了蛋白質(zhì)折疊問題，抗原的線性表位很可能不僅僅與其氨基酸序列相關(guān)。 13.非特異性的蛋白質(zhì)的序列表位與一抗還能夠相互作用。 11、12與13都需要更換專一性更好的單克隆抗體。 我剛剛寫完的，樓主參考一下吧。 |
8樓2015-07-16 13:42:41
18761615793
木蟲 (正式寫手)
小蟲
- 應助: 172 (高中生)
- 金幣: 646.4
- 散金: 170
- 紅花: 16
- 帖子: 863
- 在線: 144.9小時
- 蟲號: 3603131
- 注冊: 2014-12-19
- 專業(yè): 抗體工程學
10樓2015-07-17 11:09:22
★
star97lx(金幣+1): 謝謝參與
star97lx(金幣+1): 謝謝參與
 |
2樓2015-07-16 08:57:17
★
star97lx(金幣+1): 謝謝參與
star97lx(金幣+1): 謝謝參與
|
|
3樓2015-07-16 08:59:31
★
star97lx(金幣+1): 謝謝參與
star97lx(金幣+1): 謝謝參與
 |
4樓2015-07-16 09:05:46
|
|
5樓2015-07-16 09:18:30
| z |
6樓2015-07-16 09:19:55
|
|
7樓2015-07-16 09:30:10
star97lx
新蟲 (小有名氣)
- 應助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 5.5
- 散金: 103
- 帖子: 87
- 在線: 18.9小時
- 蟲號: 3412506
- 注冊: 2014-09-12
- 專業(yè): 基礎(chǔ)獸醫(yī)學
9樓2015-07-16 15:44:09
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 star97lx 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 310求調(diào)劑 +3 | baibai1314 2026-03-16 | 3/150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +3 | wyyyqx 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
[考研] 材料工程（專）一志愿985 初試335求調(diào)劑 +3 | hiloiy 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 280求調(diào)劑 +7 | 咕嚕曉曉 2026-03-18 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑，一志愿:南京航空航天大學大學 ，080500材料科學與工程學碩，總分289分 +4 | @taotao 2026-03-19 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 本人考085602 化學工程 專碩 +19 | 不知道叫什么！ 2026-03-15 | 21/1050 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +5 | Mqqqqqq 2026-03-19 | 5/250 |
|
|
|
[考研]
 295復試調(diào)劑
+8
|
簡木ChuFront 2026-03-19 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 295材料求調(diào)劑，一志愿武漢理工085601專碩 +5 | Charlieyq 2026-03-19 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿 南京航空航天大學大學 ，080500材料科學與工程學碩 +5 | @taotao 2026-03-20 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703化學調(diào)劑 +10 | 妮妮ninicgb 2026-03-15 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 266求調(diào)劑 +5 | 陽陽哇塞 2026-03-14 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 一志愿福大288有機化學，求調(diào)劑 +3 | 小木蟲200408204 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +12 | 小熊joy 2026-03-14 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +6 | 簡單點0 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 293求調(diào)劑 +11 | zjl的號 2026-03-16 | 16/800 |
|
|
|
[考研] 277調(diào)劑 +5 | 自由煎餅果子 2026-03-16 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 機械專碩325，尋找調(diào)劑院校 +3 | y9999 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703化學調(diào)劑 290分有科研經(jīng)歷，論文在投 +7 | 膩膩gk 2026-03-14 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿哈工大材料324分求調(diào)劑 +5 | 閆旭東 2026-03-14 | 5/250 |
|