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star97lx新蟲 (小有名氣)
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關(guān)于western blot轉(zhuǎn)膜，請教大神
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| 小女子最近開始做western blot實驗以求畢業(yè)，跑page顯示的是有蛋白，但是轉(zhuǎn)膜曝光之后一直沒有條帶，轉(zhuǎn)膜后看得到marker，馬上用麗春紅染，也看不到蛋白，用考馬斯亮藍(lán)染剩下的膠，發(fā)現(xiàn)上面還剩下的是小分子蛋白。求助一下大神這是什么情況：為什么小分子的蛋白還留在膠上面？膜上一直檢測不到蛋白？跪謝，不勝感激�。。�！ |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實驗經(jīng)驗 |
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star97lx
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9樓2015-07-16 15:44:09
凌波麗
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WB出現(xiàn)非特異性條帶的原因與解決方法 凌波麗 2015年7月16日 1.抗體濃度過高；降低一抗、二抗的濃度，可以分梯度進(jìn)行。 2.一抗的特異性不足；使用單克隆抗體，單克隆位點的抗原表位是唯一的，多克隆位點的表位不唯一。 3.二抗的非特異性結(jié)合，不加一抗，其他操作不變，即可檢測出二抗的非特異性的條帶是否來自二抗的非特異性結(jié)合；此時需要重新選擇二抗。 4.樣品蛋白質(zhì)上樣量過大；降低上樣量，可以分梯度進(jìn)行。 5.樣品蛋白質(zhì)發(fā)生了降解，降解產(chǎn)物成為了一抗或二抗的新的抗原，尤其是在一抗或二抗不是單克隆抗體時更為明顯；避免對樣品蛋白質(zhì)反復(fù)凍融，食用新鮮的蛋白質(zhì)樣品，可以使用蛋白酶的廣譜抑制劑（已經(jīng)有商用產(chǎn)品），必要的話使用分子篩層析或HPLC純化蛋白質(zhì)樣品后再上樣（HPLC不能用于蛋白質(zhì)制備，不過用做WB的量還是能夠提供的）。 6.細(xì)胞傳代過多，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變異。使用傳代次數(shù)少的細(xì)胞的表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行對比，并且作為分子篩層析或HPLC的純化標(biāo)準(zhǔn)，分子篩層析或HPLC能夠分離出構(gòu)象差異的同分異構(gòu)體�？梢栽谏蠘忧�，用紅外、紫外光譜檢測一下，并且對比標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)據(jù)。 7.因為WB的一抗識別的蛋白質(zhì)的表位是順序表位，不是空間表位，所以WB狀態(tài)下的抗原-抗體識別，與非變性的生理條件下的抗原-抗體識別不同。 8.WB之前，先用分子篩純化同時也是檢測一下目的蛋白產(chǎn)物是否成功。也就是目的蛋白是否成功表達(dá)了，而且在提取后穩(wěn)定存在了。 9.非特異性的條帶分子量出現(xiàn)可能是SDS PAGE出的問題，膠的濃度不合適或者樣品溶解度不夠或者電泳時間不合適等，造成了目的條帶的表觀質(zhì)量變化。但是如果最終帶與目的蛋白質(zhì)的分子量差距非常大，那么就不是SDSPAGE電泳引起的蛋白質(zhì)的表觀分子量變化的問題了。 10.多個非特異性的分子量不同的帶出現(xiàn)可能是目的蛋白在SDS PAGE電泳出的問題出了問題，也可能本來就是雜帶了�？梢曰厥蘸髮Ω鳁l帶用質(zhì)譜檢測精確的分子量加以確定。 11.多個非特異性的分子量不同的條帶至少應(yīng)該有雜帶，雜帶出現(xiàn)而且與一抗相互作用，那么只能說雜帶的順序表位也能被一抗識別，必須更換專一性更高的抗體。 12.使是線性表位在“變性蛋白質(zhì)抗原”的折疊態(tài)中也可能會產(chǎn)生空間位阻的問題： （1）因為“變性蛋白質(zhì)抗原”中的線性表位的空間位阻可能不同于“復(fù)性蛋白質(zhì)抗原”的線性表位的空間位阻，這樣“變性蛋白質(zhì)抗原”的線性表位產(chǎn)生的抗體，使得“復(fù)性蛋白質(zhì)抗原”-“變性蛋白質(zhì)的抗體”彼此根本接近不了，而使“變性蛋白質(zhì)的抗體”無法識別“復(fù)性蛋白質(zhì)”的線性表位； （2）可能“變性蛋白質(zhì)的抗體”能夠識別“復(fù)性蛋白質(zhì)”的線性表位，但是由于“變性蛋白質(zhì)”的抗體與“復(fù)性蛋白質(zhì)”的相互作用時由于位阻而導(dǎo)致“變性蛋白質(zhì)”的抗體與“復(fù)性蛋白質(zhì)”的接觸面無法發(fā)生有效的空間形狀的變形契合以及使兩者的接觸面無法發(fā)生電荷有效的互補，從而使得抗原-抗體反應(yīng)不能有效發(fā)生，沒有具體檢測不可以排除這種可能性； 另外一個問題：變性蛋白質(zhì)的抗原的不同于復(fù)性蛋白質(zhì)抗原的折疊態(tài)，未必不會使變性蛋白質(zhì)的抗原有新的線性表位或空間表位形成，變性蛋白質(zhì)的抗原產(chǎn)生的抗體可就復(fù)雜了。 上面說的比較拗口，不知道各位能否看明白，總之，加入了蛋白質(zhì)折疊問題，抗原的線性表位很可能不僅僅與其氨基酸序列相關(guān)。 13.非特異性的蛋白質(zhì)的序列表位與一抗還能夠相互作用。 11、12與13都需要更換專一性更好的單克隆抗體。 我剛剛寫完的，樓主參考一下吧。 |
8樓2015-07-16 13:42:41
18761615793
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| 具體問題具體分析，樓上的大神雖然說的內(nèi)容很好很正確，但是你的這個明顯是蛋白沒有轉(zhuǎn)移到膜上，蛋白還在你的膠上沒有什么特異不特異的問題。轉(zhuǎn)膜這一步失敗了，首先轉(zhuǎn)膜時，膜和膠之間不能有任何氣泡，否則肯定轉(zhuǎn)不上去，其次觀察夾子正負(fù)極沒有放反（一開始做實驗我就干過這事），轉(zhuǎn)移緩沖液的配置日期使用次數(shù)（一般3次以下），膜在轉(zhuǎn)之前甲醇浸泡1min，你這個我估計是有氣泡，所以沒轉(zhuǎn)上，一般都是可以成功的，祝好運了 |
10樓2015-07-17 11:09:22
18761615793
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11樓2015-07-17 11:12:08
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