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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告

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鐵蟲 (小有名氣)

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[求助] ELISA陰性對(duì)照顯色問題已有2人參與

原理：檢測(cè)蛋白與結(jié)合蛋白能夠相互作用結(jié)合，結(jié)合蛋白帶C-FC標(biāo)簽，最后加入FC抗體（帶HRP),TMB顯色。
檢測(cè)蛋白：A1-A8，B1-B8(復(fù)孔)
陰性對(duì)照：A9-A10，B9-B10(復(fù)孔)
說明：1-8中結(jié)合蛋白濃度依次減半，陰性對(duì)照中所加的結(jié)合蛋白濃度與A1相同。陰性對(duì)照用BSA包板，其他的操作與檢測(cè)孔一樣。
問題：為什么我的陰性對(duì)照顏色這么深？我自己感覺我的封閉和洗脫沒有問題，BSA沒有污染，但就是找不到原因，折騰了一個(gè)月了，哪位大神指點(diǎn)一下，感激不盡�。�！小弟的金幣數(shù)很少，全部拿出。感謝！
具體步驟：
1. 包被：檢測(cè)蛋白按1ul/ml的濃度包板，條件4℃過夜。
2. 洗滌：PBS清洗3次，每次2min。
3. 封閉：用3% BSA ,室溫1h。
4. 洗滌：PBS清洗3次，每次2min。
5. 結(jié)合：加入結(jié)合蛋白，37℃ 1h。
6. 洗滌：PBST清洗3次，每次2min
7. 雜交：用1%的BSA配制anti-FC抗體（比例1；10000），37℃ 1h。
8. 洗滌：PBST清洗3次，每次2min。
9. 反應(yīng)：TMB溶液避光37℃15min左右。
10. 終止：1M HCL終止。

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1樓 2015-07-28 16:27:05

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BSA包被濃度是多少，懷疑太大了，你做個(gè)BSA包被時(shí)的濃度梯度，估計(jì)也能看出來顏色變化，而且洗的時(shí)間和次數(shù)有點(diǎn)短，我一般洗5次，前兩次涮，后三次5min/time。

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2樓2015-07-30 04:43:53

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2樓: Originally posted by huiting410 at 2015-07-30 04:43:53
BSA包被濃度是多少，懷疑太大了，你做個(gè)BSA包被時(shí)的濃度梯度，估計(jì)也能看出來顏色變化，而且洗的時(shí)間和次數(shù)有點(diǎn)短，我一般洗5次，前兩次涮，后三次5min/time。

BSA包被濃度跟檢測(cè)蛋白包被濃度一樣，1ug/ml。我感覺這個(gè)因素不會(huì)影響，因?yàn)榉忾]的時(shí)候還用3%的BSA。
洗的時(shí)間我看網(wǎng)上也差不多3次每次2min

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3樓2015-07-30 09:00:59

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673643401: 金幣+2, ★有幫助 2015-07-31 09:15:18

ELISA是分子之間相互作用，要看摩爾濃度，BSA和檢測(cè)蛋白的分子量一定不一樣，往往是BSA比較大，所以你用一樣質(zhì)量濃度做對(duì)照，實(shí)際摩爾濃度BSA要大很多，那他結(jié)合的非特異就會(huì)更多了

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4樓2015-07-31 01:40:30

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補(bǔ)充，不知道你待測(cè)蛋白的分子量，BSA是66kd，不一定他會(huì)比你待測(cè)蛋白要大，你試一下摩爾濃度。至于方法你可以看一下nature protocol

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5樓2015-07-31 01:46:14

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5樓: Originally posted by huiting410 at 2015-07-31 01:46:14
補(bǔ)充，不知道你待測(cè)蛋白的分子量，BSA是66kd，不一定他會(huì)比你待測(cè)蛋白要大，你試一下摩爾濃度。至于方法你可以看一下nature protocol

1.理論上BSA是不會(huì)與我的二抗有反應(yīng)的（所以用BSA來封閉），無論BSA的包板濃度是多少。就算按照摩爾濃度進(jìn)行包板，之后的封閉用的BSA濃度更高，按照你的說法，那么非特異性結(jié)合就更多了。
2.順便問一下elisa通常從那個(gè)摩爾濃度比進(jìn)行稀釋？

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6樓2015-07-31 09:15:03

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先做個(gè)陰性實(shí)驗(yàn)，包被液中不加抗體。另外，感覺二抗反應(yīng)時(shí)間有點(diǎn)長(zhǎng)，可以減減時(shí)間。關(guān)于洗板的問題，多洗洗沒壞處，我一般洗4次，至于洗板時(shí)間，沒關(guān)心過，一般是2min左右，我的是機(jī)洗的，呵呵�。�

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7樓2015-07-31 11:27:25

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7樓: Originally posted by 天劍 at 2015-07-31 11:27:25
先做個(gè)陰性實(shí)驗(yàn)，包被液中不加抗體。另外，感覺二抗反應(yīng)時(shí)間有點(diǎn)長(zhǎng)，可以減減時(shí)間。關(guān)于洗板的問題，多洗洗沒壞處，我一般洗4次，至于洗板時(shí)間，沒關(guān)心過，一般是2min左右，我的是機(jī)洗的，呵呵��！

我的陰性對(duì)照包被液中沒加抗體啊，加的是BSA。你的二抗反應(yīng)多長(zhǎng)時(shí)間？

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8樓2015-07-31 12:48:07

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8樓: Originally posted by 673643401 at 2015-07-31 12:48:07
我的陰性對(duì)照包被液中沒加抗體啊，加的是BSA。你的二抗反應(yīng)多長(zhǎng)時(shí)間？...

包被不加抗體，加OVA封閉對(duì)照一下。先解決是否和BSA有交叉反應(yīng)，再優(yōu)化其他條件。

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9樓2015-08-03 09:18:29

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9樓: Originally posted by 天劍 at 2015-08-03 09:18:29
包被不加抗體，加OVA封閉對(duì)照一下。先解決是否和BSA有交叉反應(yīng)，再優(yōu)化其他條件。...

謝謝了，我找到大概的原因了我洗滌的原因

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10樓2015-08-03 10:08:14

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