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yyong2新蟲 (初入文壇)
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[交流]
畢赤酵母重組轉(zhuǎn)化子pcr鑒定問題 已有3人參與
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各位同仁大俠好： 我最近在做給一個(gè)基因的C端加上標(biāo)簽以便于后期蛋白純化研究其結(jié)構(gòu)，采用的是pcr介導(dǎo)的同源重組。目標(biāo)區(qū)域上下游各取51-54bp的同源序列作為pcr引物一部分，另加載體引物22bp，利用攜帶標(biāo)簽和篩選標(biāo)記的質(zhì)粒做模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr產(chǎn)物測序正確，pcr產(chǎn)物純化后電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母X33中，Zeocin篩選，30度培養(yǎng)3天后有轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)，搖菌、抽提酵母基因組DNA，以此為模板進(jìn)行pcr，抗性基因有產(chǎn)物，但是跨插入?yún)^(qū)域的引物pcr結(jié)果顯示此區(qū)域沒有插入（即pcr產(chǎn)物是正常非插入大小），再選一個(gè)插入片段內(nèi)的引物和目標(biāo)區(qū)域的組合得不到pcr產(chǎn)物。從抗性篩選標(biāo)記來說目的片段是整合到酵母基因組中的，但是整合位置似乎不在目標(biāo)區(qū)域（因?yàn)閜cr檢測不到有插入），那能整合到基因組的什么位置呢？不解？？？求解，感謝！我只有一個(gè)金幣全給啊 |
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4樓2018-11-14 20:53:58
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