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[交流]
畢赤酵母重組轉化子pcr鑒定問題 已有3人參與
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各位同仁大俠好： 我最近在做給一個基因的C端加上標簽以便于后期蛋白純化研究其結構，采用的是pcr介導的同源重組。目標區(qū)域上下游各取51-54bp的同源序列作為pcr引物一部分，另加載體引物22bp，利用攜帶標簽和篩選標記的質粒做模板進行pcr擴增，pcr產物測序正確，pcr產物純化后電轉化到畢赤酵母X33中，Zeocin篩選，30度培養(yǎng)3天后有轉化子出現(xiàn)，搖菌、抽提酵母基因組DNA，以此為模板進行pcr，抗性基因有產物，但是跨插入區(qū)域的引物pcr結果顯示此區(qū)域沒有插入（即pcr產物是正常非插入大小），再選一個插入片段內的引物和目標區(qū)域的組合得不到pcr產物。從抗性篩選標記來說目的片段是整合到酵母基因組中的，但是整合位置似乎不在目標區(qū)域（因為pcr檢測不到有插入），那能整合到基因組的什么位置呢？不解？？？求解，感謝！我只有一個金幣全給啊 |
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4樓2018-11-14 20:53:58
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