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shxteacher鐵桿木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[交流]
關(guān)于NTA-Ni純化帶有Flag標(biāo)簽的融合蛋白
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本人今天實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一個(gè)奇怪的現(xiàn)象： 我講帶有Flag標(biāo)簽的融合蛋白的細(xì)胞裂解液過(guò)NTA-Ni的重力柱，然后用1xBinding buffer洗柱子（15倍柱體積），然后直接用1xStrip buffer（主要成分是EDTA溶液），并且收集1xStrip buffer的洗脫液（1倍柱體積），然后跑SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)比較純的而且是帶有Flag標(biāo)簽的目的蛋白。 說(shuō)明：目的蛋白僅帶有Flag標(biāo)簽，不帶有His標(biāo)簽。 我很疑惑：難道Flag標(biāo)簽的融合蛋白也可以吸附在NTA-Ni重力柱？ Flag tag的蛋白序列：DYKDDDDK His tag的蛋白質(zhì)序列：HHHHHH 我在懷疑是不是Flag標(biāo)簽中含有較多的天冬氨酸，也可以螯合Ni？ 不知道有木有科研同仁遇到這樣的情況？ |
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西門(mén)吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-09-14 23:07:12
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5樓2015-09-14 22:32:11
lxzk
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 69 (初中生)
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2樓2015-09-13 09:51:39
naringenin
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3樓2015-09-13 15:49:27
hc-material
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
西門(mén)吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-09-14 23:06:49
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
西門(mén)吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-09-14 23:06:49
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存在很多疑點(diǎn)： 1.上樣量多少，是否過(guò)量。 2.你依據(jù)什么判斷的不帶HIS標(biāo)簽？？？？你用還有EDTA的溶液洗脫，鎳離子被EDTA結(jié)合，從柱子上洗脫下，同時(shí)，HIS標(biāo)簽也會(huì)被洗脫下來(lái)。 3.要判斷，你先用咪唑試試，用EDTA 洗脫，說(shuō)不含有HIS標(biāo)簽有點(diǎn)草率，你用EDTA洗鎳柱，你的鎳柱那能用么？？你要再生重新掛捏么。 |
4樓2015-09-14 09:35:45
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