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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 生物化學 » 克隆相關
| 查看: 1412 | 回復: 16 | ||||
[交流]
克隆相關 已有8人參與
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我現(xiàn)在在做分子克隆的實驗，骨架和片段都是用ASCI酶切的，大小分別是：6219bp、6422bp，T4連接酶連，16度5、6個小時或者過夜，骨架和片段體積比是1:7，長斑的情況不定，有時多有時少，做菌液電泳有時候有滯后的但酶切檢測不對，做了三個多月了， ，擔心我的畢業(yè) 望大家給些高見啊 |
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 蟲友問答-分子生物 |
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dorecnu
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2015-09-28 22:55:11
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2015-09-28 22:55:11
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PCR產物是否是回收后直接酶切？如果是請將片段連到simple 19T載體上之后再酶切。 新手往往覺得我在PCR引物末端設計了酶切位點和保護堿基就萬事大吉了，實際經驗是NONONO 在載體和片段連接過程中有一個重要的環(huán)節(jié)是酶切位點是否都完整，PCR產物直接酶切的 弊端是不知道插入 片段酶切位點的狀況。先將片段鏈接到T載體后酶切，可以清楚的獲得這一狀態(tài)。 然后在將載體用堿性磷酸酶去磷酸化后按載體：片段=1：3的比例連接。 先連T載體看起來繁瑣，實際上每個過程都能檢測，實際上有助于后續(xù)實驗更快的進行。 連接酶在室溫工作挺好，且可以節(jié)約時間。 |
7樓2015-09-28 19:44:08
wuyuanqing
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2樓2015-09-25 23:23:27
3樓2015-09-26 03:10:58
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4樓2015-09-26 09:28:30
5樓2015-09-28 19:06:28
6樓2015-09-28 19:08:01
jackyoung
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2015-09-28 22:55:31
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建議比例換成1:3或1:2，載體務必去磷酸化，鑒定時酶切應該不好判定結果，可以選擇片段上的單酶切位點切，也可以用Asc 1加載體或片段上的組合酶切。如此，祝好。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2015-09-28 20:00:42
9樓2015-09-29 00:49:24
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10樓2015-09-29 05:03:47
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