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xiamuxi新蟲 (小有名氣)
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我現(xiàn)在在做分子克隆的實(shí)驗(yàn)，骨架和片段都是用ASCI酶切的，大小分別是：6219bp、6422bp，T4連接酶連，16度5、6個(gè)小時(shí)或者過(guò)夜，骨架和片段體積比是1:7，長(zhǎng)斑的情況不定，有時(shí)多有時(shí)少，做菌液電泳有時(shí)候有滯后的但酶切檢測(cè)不對(duì)，做了三個(gè)多月了， ，擔(dān)心我的畢業(yè) 望大家給些高見啊 |
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西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2015-09-28 22:55:11
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PCR產(chǎn)物是否是回收后直接酶切？如果是請(qǐng)將片段連到simple 19T載體上之后再酶切。 新手往往覺得我在PCR引物末端設(shè)計(jì)了酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基就萬(wàn)事大吉了，實(shí)際經(jīng)驗(yàn)是NONONO 在載體和片段連接過(guò)程中有一個(gè)重要的環(huán)節(jié)是酶切位點(diǎn)是否都完整，PCR產(chǎn)物直接酶切的 弊端是不知道插入 片段酶切位點(diǎn)的狀況。先將片段鏈接到T載體后酶切，可以清楚的獲得這一狀態(tài)。 然后在將載體用堿性磷酸酶去磷酸化后按載體：片段=1：3的比例連接。 先連T載體看起來(lái)繁瑣，實(shí)際上每個(gè)過(guò)程都能檢測(cè)，實(shí)際上有助于后續(xù)實(shí)驗(yàn)更快的進(jìn)行。 連接酶在室溫工作挺好，且可以節(jié)約時(shí)間。 |
7樓2015-09-28 19:44:08
wuyuanqing
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3樓2015-09-26 03:10:58
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4樓2015-09-26 09:28:30
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5樓2015-09-28 19:06:28
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6樓2015-09-28 19:08:01
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建議比例換成1:3或1:2，載體務(wù)必去磷酸化，鑒定時(shí)酶切應(yīng)該不好判定結(jié)果，可以選擇片段上的單酶切位點(diǎn)切，也可以用Asc 1加載體或片段上的組合酶切。如此，祝好。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2015-09-28 20:00:42
iszku
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9樓2015-09-29 00:49:24
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10樓2015-09-29 05:03:47
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