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LeonardoChen金蟲 (小有名氣)
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[交流]
重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后提的平板有很多菌落，但是菌落PCR 沒有結(jié)果。 已有6人參與
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重組質(zhì)粒PET28a，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（BL21），涂布到平板，37℃，培養(yǎng)14h左右，單菌落數(shù)有很多然后隨機(jī)挑取10單菌落，加入50微升無菌水，煮沸40min，做菌落PCR，第一次pcr體系是：10微升buffer ，1微升Taq ，1微升dNTP MIX ，1微升T7引物 ，1微升T7Terminator ，86微升無菌水。分裝每管9微升，再加入1微升煮沸的菌液，進(jìn)行PCR，跑膠結(jié)果顯示有陽性克隆，但是測序結(jié)果顯示都是假陽性。 第二次嘗試用另一種方法：10微升buffer ，1微升Taq ，1微升dNTP MIX ，1微升T7Terminator ，1微升引物R（就是自己剛開始做克隆設(shè)計(jì)的引物） ，86微升無菌水。分裝每管9微升，再加入1微升煮沸的菌液，進(jìn)行PCR，跑膠結(jié)果顯示都沒有陽性克隆。 PCR反應(yīng)條件：95℃ 5min，Sample Text 72℃ 10min，4.0℃ pause 各位能不能幫我分析下，為什么單菌落那么多卻沒有陽性克隆，如果是實(shí)驗(yàn)操作的原因最可能會(huì)出現(xiàn)在哪一步？謝謝，不甚感激！ |
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2樓2015-09-29 09:42:38
董博士
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3樓2015-09-30 09:29:14
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4樓2015-09-30 10:38:31
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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我最近也是pet28a轉(zhuǎn)21斑長的很多 不過驗(yàn)證完沒有 有時(shí)候在目的位置有奇形怪狀的條帶 然后果斷提了質(zhì)粒 再驗(yàn)證就有條帶了 也搞不懂什么原因 你也可以隨機(jī)挑幾個(gè)提質(zhì)粒試試 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2015-10-16 16:24:30
梁小昌
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6樓2015-10-16 16:37:53
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我們沒有做過菌落PCR，轉(zhuǎn)化，就挑單菌落提質(zhì)粒，然后酶切檢測。不過在此，想知道，菌落PCR原理是什么？怎樣確認(rèn)連接與否！新生求告知，謝謝！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2015-10-16 17:36:01
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