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[求助]
畢赤酵母高拷貝篩選 已有2人參與
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如題，本人新手，做蛋白分子改造的，之前將目的基因構(gòu)建在pPICZaA和pGAPZaA上并利用博萊霉素篩選高拷貝，濃度達(dá)到1ug/ml，菌落PCR后挑取陽性菌落搖瓶表達(dá)，結(jié)果表達(dá)量極低�，F(xiàn)在改變策略構(gòu)建到pPIC9K上用G418篩選高拷貝，想問問各位達(dá)人G418能不能和氨芐同時使用，因?yàn)橹白龅臅r候涂布His+轉(zhuǎn)化子的G418平板老是不長酵母而長雜菌。另外還想問問是不是帶有his tag的蛋白酵母的表達(dá)量會降低？因?yàn)槲蚁胍帽容^高表達(dá)量的菌株對該蛋白進(jìn)行表征。有文獻(xiàn)建議His+轉(zhuǎn)化子不經(jīng)過G418篩選高拷貝而直接以深孔板培養(yǎng)篩選高表達(dá)量菌株，各位覺得哪種方法更靠譜呢？在同一個梯度的平板上，各菌株的表達(dá)量差異會否很大？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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luwei13566
木蟲 (正式寫手)
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- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
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不確定你博萊霉素是怎么篩多拷貝的，只要方法得當(dāng)1000ng篩出來的已經(jīng)是多拷貝了，換pic9K再篩更高拷貝我估計(jì)分泌量不會提高多少， 1.LZ你可以破碎一下甲醇誘導(dǎo)后的菌體，我感覺胞內(nèi)可能會有蛋白積累。如果有明顯的積累那就不是表達(dá)量高低的問題。 2.如果確證是表達(dá)量低，你發(fā)酵條件的問題對表達(dá)量影響更大，代謝甲醇完全靠溶氧，轉(zhuǎn)速至少200轉(zhuǎn)是不行的，如果條件不允許，完全可以做一個不同梯度裝液量的實(shí)驗(yàn)，無論拷貝數(shù)高低都拿一個轉(zhuǎn)化子來做一下。 3.至于你加amp無非是想把雜菌給壓下去，應(yīng)該可以，就怕那個雜菌不怕amp,還是多注意注意操作吧 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
29樓2015-10-09 02:34:17
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2015-10-07 22:53:11
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵回帖交流 2015-10-07 22:53:11
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梯度加壓，增加zeocin濃度，篩選到2000的濃度，調(diào)取克隆進(jìn)行表達(dá)小試進(jìn)一步篩選。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，高濃度板子上長出來的克隆表達(dá)量不見得高，曾有過不表達(dá)的情況。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2015-10-05 00:11:58
3樓2015-10-05 00:25:14
3976084924樓2015-10-05 12:29:11
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