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LY1199鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的問(wèn)題 已有1人參與
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我用絕對(duì)定量的 qPCR 測(cè)定某個(gè)基因A在土壤樣品中的copy數(shù)目 查了好多文獻(xiàn)，大都是：采用還有這個(gè)A基因的單拷貝質(zhì)粒DNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備，將其稀釋到一定倍數(shù)， 這里產(chǎn)生了疑問(wèn) 1）為什么要構(gòu)建含A基因的單拷貝質(zhì)粒 2）直接利用A基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行目的片段濃度確定，再轉(zhuǎn)換成copies/ul等形式，不可以嗎？？為什么？？ |
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懶蛋
鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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樓上完全正確。此外 pcr 產(chǎn)物做模版，擴(kuò)增效率沒(méi)有質(zhì)粒高，有時(shí)可能卡在70%再上不去了。因?yàn)橐颽nneal到質(zhì)粒上的概率要高于pcr 片段，因?yàn)閜cr兩端再無(wú)其他序列可target。 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
4樓2015-10-26 00:11:27
高gaoeryang
銀蟲(chóng) (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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LY1199: 金幣+5, ★★★很有幫助 2015-11-21 14:10:34
LY1199: 金幣+5, ★★★很有幫助 2015-11-21 14:10:34
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使用質(zhì)粒有以下原因： （1） 很多實(shí)驗(yàn)者都推薦之。 （2） 質(zhì)粒比較純。 （3） 質(zhì)粒穩(wěn)定。 （4） 質(zhì)粒定量準(zhǔn)確。 （5） 質(zhì)粒制備方便，廉價(jià)，大量。 （6） 使用質(zhì)粒來(lái)開(kāi)始學(xué)習(xí)/試驗(yàn)real time PCR, 可以減少模板誤差，就易于摸索其它條件的優(yōu)化。 PCR產(chǎn)物也可以，但是： （1） 短，線(xiàn)性→不穩(wěn)定。 （2） 模板就是擴(kuò)增子，末端就是引物結(jié)合部位，端點(diǎn)降解直接影響引物結(jié) 合。 |
3樓2015-10-23 16:48:04
劉阿杰T
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請(qǐng)教一下，不太懂QPCR的做法，只能先提取RNA，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA 再進(jìn)行以后的步驟，還是可以直接用DNA也可以？ 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
5樓2017-11-22 10:25:32
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