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a13515517892木蟲 (小有名氣)
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[交流]
qpcr實驗復孔后的問題 已有8人參與
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做細胞水平的驗證時，發(fā)生了很詭異的結(jié)果，就是我的目的基因都P出來，并且重現(xiàn)性和復孔之間的差距都很小，但是內(nèi)參基因GAPDH確很不穩(wěn)定，復孔之間會差5個以上的Ct值，我做了8次了，每次都不一樣，而且差距都很大，復孔之間始終存在很大的差異，以前做組織時都沒有這種現(xiàn)象，但是GAPDH的溶解曲線峰值很好，都是83.5,而且沒有雜峰。我為了防止可能是自己操作的誤差，把所有Mix和模板，引物都加在一個管子里混勻了，在分到不同的PCR管中，可是復孔之間還是差距很大。我做了4個復孔，有3個復孔的Ct12，有1個復孔是4。跑膠的結(jié)果是12和4的復孔的亮度沒什么區(qū)別，你覺得可能是什么原因呢？ 組織和細胞水平一起做的時候，組織中的GAPDH都很正常，復孔之間沒有什么差距，就是細胞特別不穩(wěn)定。 |
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