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a13515517892木蟲(chóng) (小有名氣)
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qpcr實(shí)驗(yàn)復(fù)孔后的問(wèn)題 已有8人參與
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做細(xì)胞水平的驗(yàn)證時(shí)，發(fā)生了很詭異的結(jié)果，就是我的目的基因都P出來(lái)，并且重現(xiàn)性和復(fù)孔之間的差距都很小，但是內(nèi)參基因GAPDH確很不穩(wěn)定，復(fù)孔之間會(huì)差5個(gè)以上的Ct值，我做了8次了，每次都不一樣，而且差距都很大，復(fù)孔之間始終存在很大的差異，以前做組織時(shí)都沒(méi)有這種現(xiàn)象，但是GAPDH的溶解曲線峰值很好，都是83.5,而且沒(méi)有雜峰。我為了防止可能是自己操作的誤差，把所有Mix和模板，引物都加在一個(gè)管子里混勻了，在分到不同的PCR管中，可是復(fù)孔之間還是差距很大。我做了4個(gè)復(fù)孔，有3個(gè)復(fù)孔的Ct12，有1個(gè)復(fù)孔是4。跑膠的結(jié)果是12和4的復(fù)孔的亮度沒(méi)什么區(qū)別，你覺(jué)得可能是什么原因呢？ 組織和細(xì)胞水平一起做的時(shí)候，組織中的GAPDH都很正常，復(fù)孔之間沒(méi)有什么差距，就是細(xì)胞特別不穩(wěn)定。 |
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3樓2015-10-25 21:43:25
444565008qq
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2樓2015-10-25 19:52:00
懶蛋
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你的gapdh ct太低了，稀釋一下，讓他維持在15-18，濃度太高了ct 會(huì)不穩(wěn)定 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
4樓2015-10-25 23:51:39
懶蛋
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其實(shí)有三個(gè)重復(fù)都是12，那4那個(gè)重復(fù)就可以不算了，要那么多重復(fù)你老板不心疼？ 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
5樓2015-10-25 23:53:43
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