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[求助]
緊急求助~PCR產(chǎn)物電泳條帶，特別奇怪，LZ好崩潰，，跪求各位提供幫助 已有2人參與
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各位好~~小妹新手在此求助 打算做qPCR標(biāo)準(zhǔn)品，現(xiàn)在用qPCR引物做普通PCR，擴(kuò)增條件95℃8min，（95℃ 30s /55℃ 30S / 72℃ 30S ）35個(gè)循環(huán)，72 10min，體系takra premix Taq（Ex taq verson 2.0）10u /正反引物（10mM）各1u/模版1u，電泳條帶有兩條，還算清晰，但并不是目的條帶，其實(shí)目的條帶只有100多bp, 條帶居然有1000多bp,提高退火溫度到60℃，條帶也是這樣的，空白對(duì)照除了引物并沒(méi)有其它條帶，請(qǐng)各位幫忙分析下原因，有沒(méi)有人遇到這種情況？ 還有一開(kāi)始以為是引物合成錯(cuò)了，重新合成了一份，條帶依然是這樣的，我實(shí)在沒(méi)轍了，，引物是采用文獻(xiàn)里面的，很多外文文獻(xiàn)都用過(guò)。。。。我的模版DNA是海水全基因組DNA 附電泳圖 marker是DL2000 圖1 膠孔依次是marker/sample1/blank 圖2 膠孔依次是marker/sample1/sample2 圖片1.jpg 圖片2.jpg |
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3樓2015-11-11 20:45:29
zhangjingwjs
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2樓2015-11-11 20:42:02
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【答案】應(yīng)助回帖
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| 樓主你好。你看你從基因組里面P出了很多條帶，但是沒(méi)有目的條帶，這說(shuō)明了一個(gè)事實(shí)：你設(shè)計(jì)的引物的特異性不夠好，所以才能P出非特異性的條帶。目的條帶沒(méi)有P出來(lái)，可能是因?yàn)椋孩偻嘶饻囟炔徽_，雖然說(shuō)是要TM減5-10度，但是具體溫度需要自己摸索，建議拉一個(gè)溫度梯度。②樓主之后72度 10分鐘我認(rèn)為這是不正確的，可以嘗試循環(huán)后保持4度或者直接取出產(chǎn)物。 |
4樓2015-11-11 22:18:23
zhangjingwjs
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5樓2015-11-11 23:47:18
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