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蛋白質純化親和層析分離技術
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每一種新思想形成的背后都在積極面對“死胡同”時失落； 每一種新方法的產生也在處處留心每跨一步留下的腳印； 就像不積跬步無以至千里，不積小流無以成江海，一點一點的走心勞動，時間會在某個點積累匯聚，來到你想要的時刻。 這篇文章的主角是蛋白純化親和層析技術，在此概述了蛋白純化親和吸附層析的原理、應用等，該技術同樣經過多年的慢慢演變過程，中間經歷了前人的經驗和智慧，才發(fā)展形成現在的一種新技術， 1910年時，淀粉吸附淀粉水解酶；1951年，免疫吸附劑能夠分離抗體；1967年，胰蛋白酶的不容酶提純胰蛋白酶抑制劑。 所以，給予你的實驗，包括時間、經歷、探索、思維、心態(tài)，慢慢磨練，等待想要的實驗結果。 ——致終在實驗臺邊奮斗的你 蛋白質親和層析技術的原理 蛋白質親和層析技術適應于理化性質差異性較小而難分離的蛋白質，親和層析利用固相介質中的配基與混合生物分子之間親和能力不同而進行分離，當蛋白混合液通過層析柱時，與配基能夠特異性結合的蛋白質就會被吸附固定在層析柱中，其他的蛋白質對配體不具有特異性的結合能力，將通過柱子洗脫下來，這種結合在一定條件下是可逆的，選用適當的洗脫液，改變緩沖液的離子強度和pH值或者選擇更強的配體結合溶液將結合的蛋白質洗脫下來，而無親和力的蛋白質最先流出層析住。它通常只需要一步操作便能將目的蛋白從混合物中分離出來，并且純度很高。 蛋白純化親和層析的固相載體具有穩(wěn)定的理化學性質，是一種含有較多化學反應基團的羥基多糖類介質，具有機械強度高，透性好，不溶于水，非特異性吸附少，多孔網狀結構的特點。常用的載體有瓊脂糖凝膠，其他的載體如葡聚糖凝膠，多孔硅膠，樹脂，纖維素等，固相載體首先與特定的配體共價偶聯(lián)形成具有化學活性的基團，即載體的活化，常見的有溴化氰活化載體，即將含有氨基偶聯(lián)到載體的多糖基上，以及環(huán)氧氯丙烷在堿性條件下活化載體，其他的載體的活化劑還有戊二醛等。配體指被特異性蛋白質大分子所識別，并與蛋白質發(fā)生親和作用的基團，如酶的作用底物，輔酶，激素受體，抗原與抗體的結合等； 蛋白質與層析載體上的配體通過共價鍵、范德華力、疏水力、靜電力等作用發(fā)生生物學專一性結合形成復合物，共價鏈接在載體表面的功能團配體上。蛋白質親和層析技術通過目標蛋白質與配體間通過特異性親和力吸附而達到分離純化的目的，具有生物專一性的特點，純化效率高。 蛋白質親和層析的應用分類： 抗原抗體的免疫親和層析 利用抗原與抗體之間的特異性親和力而進行分離的方法。所需的蛋白質作為抗原，經過動物免疫后形成抗體，抗體與活化的載體上的配基結合形成具有親和力的吸附劑，利用目標蛋白與載體上的抗體特異性結合而達到分離純化蛋白的目的。 生物素和親和素 生物素和親和素之間具有很強的特異性的親和力。親和素作為配體固定在載體上，將生物大分子用生物素標記，通過親和素特異性吸附標記的生物大分子而純化分離目標物質。例如，生物素酰化的胰島素與以親和素為配體的瓊脂糖結合，胰島素被固定在瓊脂糖柱子上而得到分離。 激素與受體蛋白 激素與受體蛋白具有高的親和力，因此親和層析是分離受體蛋白的重要方法。受體蛋白如乙酰膽堿、腎上腺素、生長激素等，都可以利用激素與受體蛋白的特異性結合而分離； 凝集素與糖蛋白 帶有糖基化的蛋白可用于含有外源凝集素的親和柱進行分離，用凝集素作為配體的親和層析是分離糖蛋白的主要方法。 輔酶 利用輔酶對多種酶的親和力可以對多種酶進行分離純化。常用的輔酶有核苷酸及其衍生物，比如腺嘌呤核苷酸輔酶，AMP、ADP、ATP等，以及各種維生素，可以用于分離各種激酶和脫氫酶。 氨基酸表面疏水性 固定化氨基酸作為配體，利用氨基酸間的疏水性質或者互補蛋白間的親和力，可以分離純化多種蛋白。 共價結合吸附 主要利用重組標簽蛋白質與金屬吸附柱之間通過共價結合吸附而分離純化標簽蛋白質。如GST（谷胱甘肽S轉移酶）標簽融合蛋白純化以及His（組氨酸）標簽融合蛋白純化。將谷胱甘肽S轉移酶與重組蛋白或者多肽鏈融合， GST標簽融合蛋白通過谷胱甘肽S轉移酶與固相載體上的谷胱甘肽之間通過酶與底物之間的共價特異性結合，從而達到和其他蛋白分離的目的。 金屬螯合吸附 常用于分離對重金屬有較強親和力的蛋白。金屬螯合通常使用亞胺二乙酸（IDA）螯合劑，它與Cu2+、Fe2+作用，形成帶有多個配位基的螯合物，固定在載體上，作為配體吸附對重金屬有特異結合能力的蛋白。例如利用基因工程構建帶標簽的蛋白His（組氨酸）標簽融合蛋白，該蛋白對Ni2+等金屬離子有高選擇的特異性，因此，Ni2+等金屬離子能夠螯合His標簽蛋白并吸附在固相載體上，而其他的蛋白質不能結合或者僅能微弱的結合，從而能夠分離純化目標蛋白。 多核苷酸和核酸配體 Poly-A配體能夠結合各種RNA、RNA聚合酶以及其他的poly-A結合蛋白。 poly-U作為配體用于分離mRNA、以及各種poly-U結合蛋白。DNA作為配體，能夠特異性結合各種DNA結合蛋白、DNA聚合酶等多種酶類。 小火柴的光芒： 科學的靈感，決不是坐等可以等來的。如果說，科學上的發(fā)現有什么偶然的機遇的話，那么這種“偶然的機遇”只能給那些學有素養(yǎng)的人，給那些善于獨立思考的人，給那些具有鍥而不舍的精神的人，而不會給懶漢。 ——華羅庚 規(guī)律總產生于問題之后，問題或許是一種困難，但也是一種機遇，所以，有點追求的你，也該為了擁抱大海堅持一下。 |
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