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蛋白質(zhì)純化親和層析分離技術(shù)
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每一種新思想形成的背后都在積極面對“死胡同”時(shí)失落； 每一種新方法的產(chǎn)生也在處處留心每跨一步留下的腳�。� 就像不積跬步無以至千里，不積小流無以成江海，一點(diǎn)一點(diǎn)的走心勞動，時(shí)間會在某個(gè)點(diǎn)積累匯聚，來到你想要的時(shí)刻。 這篇文章的主角是蛋白純化親和層析技術(shù)，在此概述了蛋白純化親和吸附層析的原理、應(yīng)用等，該技術(shù)同樣經(jīng)過多年的慢慢演變過程，中間經(jīng)歷了前人的經(jīng)驗(yàn)和智慧，才發(fā)展形成現(xiàn)在的一種新技術(shù)， 1910年時(shí)，淀粉吸附淀粉水解酶；1951年，免疫吸附劑能夠分離抗體；1967年，胰蛋白酶的不容酶提純胰蛋白酶抑制劑。 所以，給予你的實(shí)驗(yàn)，包括時(shí)間、經(jīng)歷、探索、思維、心態(tài)，慢慢磨練，等待想要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 ——致終在實(shí)驗(yàn)臺邊奮斗的你 蛋白質(zhì)親和層析技術(shù)的原理 蛋白質(zhì)親和層析技術(shù)適應(yīng)于理化性質(zhì)差異性較小而難分離的蛋白質(zhì)，親和層析利用固相介質(zhì)中的配基與混合生物分子之間親和能力不同而進(jìn)行分離，當(dāng)?shù)鞍谆旌弦和ㄟ^層析柱時(shí)，與配基能夠特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)就會被吸附固定在層析柱中，其他的蛋白質(zhì)對配體不具有特異性的結(jié)合能力，將通過柱子洗脫下來，這種結(jié)合在一定條件下是可逆的，選用適當(dāng)?shù)南疵撘�，改變緩沖液的離子強(qiáng)度和pH值或者選擇更強(qiáng)的配體結(jié)合溶液將結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫下來，而無親和力的蛋白質(zhì)最先流出層析住。它通常只需要一步操作便能將目的蛋白從混合物中分離出來，并且純度很高。 蛋白純化親和層析的固相載體具有穩(wěn)定的理化學(xué)性質(zhì)，是一種含有較多化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)的羥基多糖類介質(zhì)，具有機(jī)械強(qiáng)度高，透性好，不溶于水，非特異性吸附少，多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。常用的載體有瓊脂糖凝膠，其他的載體如葡聚糖凝膠，多孔硅膠，樹脂，纖維素等，固相載體首先與特定的配體共價(jià)偶聯(lián)形成具有化學(xué)活性的基團(tuán)，即載體的活化，常見的有溴化氰活化載體，即將含有氨基偶聯(lián)到載體的多糖基上，以及環(huán)氧氯丙烷在堿性條件下活化載體，其他的載體的活化劑還有戊二醛等。配體指被特異性蛋白質(zhì)大分子所識別，并與蛋白質(zhì)發(fā)生親和作用的基團(tuán)，如酶的作用底物，輔酶，激素受體，抗原與抗體的結(jié)合等； 蛋白質(zhì)與層析載體上的配體通過共價(jià)鍵、范德華力、疏水力、靜電力等作用發(fā)生生物學(xué)專一性結(jié)合形成復(fù)合物，共價(jià)鏈接在載體表面的功能團(tuán)配體上。蛋白質(zhì)親和層析技術(shù)通過目標(biāo)蛋白質(zhì)與配體間通過特異性親和力吸附而達(dá)到分離純化的目的，具有生物專一性的特點(diǎn)，純化效率高。 蛋白質(zhì)親和層析的應(yīng)用分類： 抗原抗體的免疫親和層析 利用抗原與抗體之間的特異性親和力而進(jìn)行分離的方法。所需的蛋白質(zhì)作為抗原，經(jīng)過動物免疫后形成抗體，抗體與活化的載體上的配基結(jié)合形成具有親和力的吸附劑，利用目標(biāo)蛋白與載體上的抗體特異性結(jié)合而達(dá)到分離純化蛋白的目的。 生物素和親和素 生物素和親和素之間具有很強(qiáng)的特異性的親和力。親和素作為配體固定在載體上，將生物大分子用生物素標(biāo)記，通過親和素特異性吸附標(biāo)記的生物大分子而純化分離目標(biāo)物質(zhì)。例如，生物素�；囊葝u素與以親和素為配體的瓊脂糖結(jié)合，胰島素被固定在瓊脂糖柱子上而得到分離。 激素與受體蛋白 激素與受體蛋白具有高的親和力，因此親和層析是分離受體蛋白的重要方法。受體蛋白如乙酰膽堿、腎上腺素、生長激素等，都可以利用激素與受體蛋白的特異性結(jié)合而分離； 凝集素與糖蛋白 帶有糖基化的蛋白可用于含有外源凝集素的親和柱進(jìn)行分離，用凝集素作為配體的親和層析是分離糖蛋白的主要方法。 輔酶 利用輔酶對多種酶的親和力可以對多種酶進(jìn)行分離純化。常用的輔酶有核苷酸及其衍生物，比如腺嘌呤核苷酸輔酶，AMP、ADP、ATP等，以及各種維生素，可以用于分離各種激酶和脫氫酶。 氨基酸表面疏水性 固定化氨基酸作為配體，利用氨基酸間的疏水性質(zhì)或者互補(bǔ)蛋白間的親和力，可以分離純化多種蛋白。 共價(jià)結(jié)合吸附 主要利用重組標(biāo)簽蛋白質(zhì)與金屬吸附柱之間通過共價(jià)結(jié)合吸附而分離純化標(biāo)簽蛋白質(zhì)。如GST（谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶）標(biāo)簽融合蛋白純化以及His（組氨酸）標(biāo)簽融合蛋白純化。將谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶與重組蛋白或者多肽鏈融合， GST標(biāo)簽融合蛋白通過谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶與固相載體上的谷胱甘肽之間通過酶與底物之間的共價(jià)特異性結(jié)合，從而達(dá)到和其他蛋白分離的目的。 金屬螯合吸附 常用于分離對重金屬有較強(qiáng)親和力的蛋白。金屬螯合通常使用亞胺二乙酸（IDA）螯合劑，它與Cu2+、Fe2+作用，形成帶有多個(gè)配位基的螯合物，固定在載體上，作為配體吸附對重金屬有特異結(jié)合能力的蛋白。例如利用基因工程構(gòu)建帶標(biāo)簽的蛋白His（組氨酸）標(biāo)簽融合蛋白，該蛋白對Ni2+等金屬離子有高選擇的特異性，因此，Ni2+等金屬離子能夠螯合His標(biāo)簽蛋白并吸附在固相載體上，而其他的蛋白質(zhì)不能結(jié)合或者僅能微弱的結(jié)合，從而能夠分離純化目標(biāo)蛋白。 多核苷酸和核酸配體 Poly-A配體能夠結(jié)合各種RNA、RNA聚合酶以及其他的poly-A結(jié)合蛋白。 poly-U作為配體用于分離mRNA、以及各種poly-U結(jié)合蛋白。DNA作為配體，能夠特異性結(jié)合各種DNA結(jié)合蛋白、DNA聚合酶等多種酶類。 小火柴的光芒： 科學(xué)的靈感，決不是坐等可以等來的。如果說，科學(xué)上的發(fā)現(xiàn)有什么偶然的機(jī)遇的話，那么這種“偶然的機(jī)遇”只能給那些學(xué)有素養(yǎng)的人，給那些善于獨(dú)立思考的人，給那些具有鍥而不舍的精神的人，而不會給懶漢。 ——華羅庚 規(guī)律總產(chǎn)生于問題之后，問題或許是一種困難，但也是一種機(jī)遇，所以，有點(diǎn)追求的你，也該為了擁抱大海堅(jiān)持一下。 |
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2015-11-16 09:51:45, 93.83 K
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