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yangqian_517新蟲 (初入文壇)
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[求助]
用植物cDNA擴增一個1700bp左右的全長序列，一直擴不出來，求助原因 已有4人參與
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| 補充：1、引物是根據(jù)已有的cDNA序列設(shè)計的；2、同樣的引物用基因組DNA做模板就能擴增出來；3、cDNA是反轉(zhuǎn)錄之后馬上就做PCR的，同時還用熒光定量的引物擴增了一段200bp的小片段，200bp的片段能擴增出來，但是全長一直擴不出來。求助有經(jīng)驗的同學(xué)給分析一下 |
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2樓2015-11-24 20:09:31
東樂樂
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yangqian_517: 金幣+5, ★有幫助 2015-11-25 18:22:58
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yangqian_517: 金幣+5, ★有幫助 2015-11-25 18:22:58
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我之前一直也是擴不出來，這兩天剛剛有點成績。我問過生物公司的技術(shù)人員，也在論壇求助過，他們說可能是因為逆轉(zhuǎn)錄不完全，有一部分的鏈沒有打開，你可以換個好一點的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，或者你可以試試用分段克隆的方法分別設(shè)計引物，克隆出幾段，然后連接起來。有說用重疊延伸pcr方法連接幾個片段的，但我用的是論壇求助時他們告訴我的方法，就是在你的目的序列里找到幾個酶切位點，在酶切位點處設(shè)計引物，分別擴增出幾個片段，酶切并膠回收后進行粘性末端連接，連完再以這個為模板，用全序列的引物進行pcr。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2015-11-24 21:28:39
【答案】應(yīng)助回帖
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基因組DNA和cDNA不一樣，你把退火溫度降一下，你用的是擴增長片段的酶嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2015-11-25 13:16:12
yangqian_517
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5樓2015-11-25 18:21:04
【答案】應(yīng)助回帖
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DNA擴出來的不一定就是你要的片段，因為畢竟有內(nèi)含子，除非你測過序了。我以前擴的時候，就1kb，怎么都擴不出，換了擴長片段的酶就擴出來了。如果你確定自己的RNA沒降解的話，可以換個酶試試。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2015-11-25 18:36:14
yangqian_517
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7樓2015-11-25 19:47:03
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