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yangqian_517新蟲 (初入文壇)
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[求助]
用植物cDNA擴(kuò)增一個(gè)1700bp左右的全長(zhǎng)序列，一直擴(kuò)不出來(lái)，求助原因 已有4人參與
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| 補(bǔ)充：1、引物是根據(jù)已有的cDNA序列設(shè)計(jì)的；2、同樣的引物用基因組DNA做模板就能擴(kuò)增出來(lái)；3、cDNA是反轉(zhuǎn)錄之后馬上就做PCR的，同時(shí)還用熒光定量的引物擴(kuò)增了一段200bp的小片段，200bp的片段能擴(kuò)增出來(lái)，但是全長(zhǎng)一直擴(kuò)不出來(lái)。求助有經(jīng)驗(yàn)的同學(xué)給分析一下 |
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yangqian_517
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 643
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- 蟲號(hào): 2845389
- 注冊(cè): 2013-12-03
- 專業(yè): 植物化學(xué)保護(hù)
5樓2015-11-25 18:21:04
2樓2015-11-24 20:09:31
東樂(lè)樂(lè)
金蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 3 (幼兒園)
- 金幣: 1083
- 帖子: 50
- 在線: 29.5小時(shí)
- 蟲號(hào): 3562569
- 注冊(cè): 2014-11-27
- 專業(yè): 流行病學(xué)方法與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
yangqian_517: 金幣+5, ★有幫助 2015-11-25 18:22:58
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
yangqian_517: 金幣+5, ★有幫助 2015-11-25 18:22:58
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我之前一直也是擴(kuò)不出來(lái)，這兩天剛剛有點(diǎn)成績(jī)。我問(wèn)過(guò)生物公司的技術(shù)人員，也在論壇求助過(guò)，他們說(shuō)可能是因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄不完全，有一部分的鏈沒(méi)有打開，你可以換個(gè)好一點(diǎn)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，或者你可以試試用分段克隆的方法分別設(shè)計(jì)引物，克隆出幾段，然后連接起來(lái)。有說(shuō)用重疊延伸pcr方法連接幾個(gè)片段的，但我用的是論壇求助時(shí)他們告訴我的方法，就是在你的目的序列里找到幾個(gè)酶切位點(diǎn)，在酶切位點(diǎn)處設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增出幾個(gè)片段，酶切并膠回收后進(jìn)行粘性末端連接，連完再以這個(gè)為模板，用全序列的引物進(jìn)行pcr。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2015-11-24 21:28:39
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
yangqian_517: 金幣+5, ★有幫助 2015-11-25 18:23:15
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
yangqian_517: 金幣+5, ★有幫助 2015-11-25 18:23:15
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基因組DNA和cDNA不一樣，你把退火溫度降一下，你用的是擴(kuò)增長(zhǎng)片段的酶嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2015-11-25 13:16:12
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