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【求助】菌液Pcr 陽性率很低，載體雙酶切后不徹底？ 已有2人參與
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研一小菜鳥一枚。上個月帶我的老師讓我構(gòu)建7個載體。現(xiàn)在已經(jīng)構(gòu)建出6個，剩下一個做了幾次都沒做出來。目的片段大小1.3Kb，載體為5Kb。用的是neb的EcorI和EcorV雙酶切，兩個酶切位點之間間隔大約750Kb。目的片段用的是neb BsmBI和EcorV酶切。載體酶切體系試過20微升和50微升，載體量分辨是1微克和2微克。目的片段全部酶切，用的是50微升體系。跑膠回收時，能看一條5Kb和一條750bp的條帶。連接用的是neb的T4,10微升體系，16度過夜。目的片段的濃度是20納克每微升，載體也是。兩者摩爾比為1:8。 結(jié)合前面6次陽性率很低的經(jīng)驗，我在連接時做了一個對照，用已經(jīng)回收的雙酶切的載體不加目的片段連接，之后做轉(zhuǎn)化。發(fā)現(xiàn)對照組長滿了菌。酶切這個步驟已經(jīng)重復兩次了，但依然如此。我試著調(diào)了16個菌落做菌液pcr，但全部為陰性。請問各位大牛怎么看？ |
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kingjazz23
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你好 可不可以先告訴我構(gòu)建的完整過程 我也是做這方面的 現(xiàn)在做到了搖菌 之前做了個菌落PCR 搖完菌打算提質(zhì)粒測序做酶切 想問問后面的步驟是什么 就是我做完酶切后還要做什么步驟 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
2樓2016-04-13 15:54:58
showhand
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4樓2016-04-29 09:35:42
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5樓2016-04-29 16:48:52
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