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小小不點(diǎn)愛(ài)新蟲 (正式寫手)
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[求助]
半定量PCR 已有3人參與
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在做半定量PCR，是應(yīng)該先用內(nèi)參調(diào)cdna濃度吧，我都稀釋了100倍了，有的還亮的不得了，我的循環(huán)數(shù)是30。同學(xué)建議可以用28循環(huán)試試，那這樣會(huì)不會(huì)影響后期平臺(tái)期的查找阿。不過(guò)，這個(gè)應(yīng)該先找平臺(tái)期確定循環(huán)參數(shù)呢還是要先用內(nèi)參調(diào)濃度阿…… 各位大神求指點(diǎn)阿 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-02-25 22:39:12
西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-02-25 22:39:12
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一般的目的基因我們?cè)O(shè)定它們的最佳循環(huán)數(shù)在25到35之間。因此，我認(rèn)為，您可以先用25循環(huán)試一次，若依舊很亮，就調(diào)節(jié)DNA濃度，直至最佳循環(huán)數(shù)處于25至35之間。 置于稀釋濃度，有兩點(diǎn)建議：1 可在反轉(zhuǎn)DNA前對(duì)RNA的濃度進(jìn)行控制，我們實(shí)驗(yàn)室采用1ugRNA對(duì)應(yīng)20倍ul的體系。2 無(wú)需在乎稀釋倍數(shù)，只要最后保證每組DNA的濃度相等即可 建議采用第一種 對(duì)于最佳循環(huán)數(shù)的測(cè)定：配相同PCR轉(zhuǎn)體系6管，循環(huán)數(shù)分別為25，27,29,31，33,35 其余條件全部相同，在同一塊膠上 一起跑膠。照膠時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)條帶有一個(gè)逐漸增量至不再增量的過(guò)程（即既是循環(huán)數(shù)增加，但條帶亮度是一樣的），這個(gè)亮度就是平臺(tái)期，此時(shí)我們?nèi)×炼葎倓偝霈F(xiàn)的條帶，然后為確保每次都有條帶出現(xiàn)，正式試驗(yàn)時(shí)在這個(gè)循環(huán)數(shù)上加2即可。 |
2樓2016-02-25 19:57:59
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-02-25 22:39:28
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-02-25 22:39:28
| 這種情況建議先做標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)參和目的基因一起做，做出各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。第一，可以確定你真實(shí)實(shí)驗(yàn)所需要的適合的模版濃度，第二你在做半定量后期的數(shù)據(jù)處理時(shí)需要用到目的基因和內(nèi)參基因各自的擴(kuò)增效率，來(lái)選擇你數(shù)據(jù)處理的方法。不用去在意你現(xiàn)在所用的稀釋倍數(shù)，這個(gè)說(shuō)明不了問(wèn)題。 |
3樓2016-02-25 20:09:24
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4樓2016-02-28 16:32:36
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5樓2019-01-31 10:40:42
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