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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » PCR相關 » 半定量PCR
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半定量PCR 已有3人參與
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在做半定量PCR，是應該先用內(nèi)參調(diào)cdna濃度吧，我都稀釋了100倍了，有的還亮的不得了，我的循環(huán)數(shù)是30。同學建議可以用28循環(huán)試試，那這樣會不會影響后期平臺期的查找阿。不過，這個應該先找平臺期確定循環(huán)參數(shù)呢還是要先用內(nèi)參調(diào)濃度阿…… 各位大神求指點阿 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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3樓2016-02-25 20:09:24
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★
西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2016-02-25 22:39:12
西門吹雪170: 金幣+4, 鼓勵回帖交流 2016-02-25 22:39:12
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一般的目的基因我們設定它們的最佳循環(huán)數(shù)在25到35之間。因此，我認為，您可以先用25循環(huán)試一次，若依舊很亮，就調(diào)節(jié)DNA濃度，直至最佳循環(huán)數(shù)處于25至35之間。 置于稀釋濃度，有兩點建議：1 可在反轉(zhuǎn)DNA前對RNA的濃度進行控制，我們實驗室采用1ugRNA對應20倍ul的體系。2 無需在乎稀釋倍數(shù)，只要最后保證每組DNA的濃度相等即可 建議采用第一種 對于最佳循環(huán)數(shù)的測定：配相同PCR轉(zhuǎn)體系6管，循環(huán)數(shù)分別為25，27,29,31，33,35 其余條件全部相同，在同一塊膠上 一起跑膠。照膠時會發(fā)現(xiàn)條帶有一個逐漸增量至不再增量的過程（即既是循環(huán)數(shù)增加，但條帶亮度是一樣的），這個亮度就是平臺期，此時我們?nèi)×炼葎倓偝霈F(xiàn)的條帶，然后為確保每次都有條帶出現(xiàn)，正式試驗時在這個循環(huán)數(shù)上加2即可。 |
2樓2016-02-25 19:57:59
4樓2016-02-28 16:32:36
你是路人甲
銅蟲 (小有名氣)
- 應助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 232
- 散金: 42
- 帖子: 191
- 在線: 24.8小時
- 蟲號: 13104654
- 注冊: 2018-12-09
- 專業(yè): 微生物遺傳育種學
5樓2019-01-31 10:40:42
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