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小冀-版主 (著名寫(xiě)手)
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[求助]
pMD-19T載體與目的片段的連接問(wèn)題 已有6人參與
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之前計(jì)劃目的基因（3.6Kb）與pMD-19T進(jìn)行TA克隆連接，目的片段用primerstar高保真酶后加A連接，氨芐板生長(zhǎng)，鑒定后發(fā)現(xiàn)是載體自連；后來(lái)用Taq酶PCR擴(kuò)增后直接與pMD-19T載體鏈接，最后發(fā)現(xiàn)還是自連的···發(fā)現(xiàn)這都不行后就進(jìn)行一步克隆（ClonExpressTM快速克隆技術(shù)），之前認(rèn)為在載體是線性的，就直接連了，但是沒(méi)有連上，氨芐平板上沒(méi)長(zhǎng)；后來(lái)用以前構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后進(jìn)行一步克隆，可是氨芐平板上還是沒(méi)有長(zhǎng)···各位大神，求助··· 轉(zhuǎn)化條件： 感受態(tài)是自己用氯化鈣法做的，以前也是用它來(lái)做轉(zhuǎn)化，都可以的··· 熱擊90s后，37℃活化1h后，將轉(zhuǎn)化液濃縮全部涂平板··· |
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kuaile5420
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4樓2014-07-25 11:38:57
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2樓2014-07-25 10:20:16
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3樓2014-07-25 11:33:56
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-07-25 13:58:12
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構(gòu)建質(zhì)粒的一般步驟： 擴(kuò)增目的基因---PCR產(chǎn)物純化，加17ul 洗脫液洗脫（PCR產(chǎn)物純化試劑盒做）---雙酶切，30或50ul 體系，純化后的PCR產(chǎn)物取 10ul，載體取 3ul，37度 約3-4h---膠回收（膠回收試劑盒做），加17ul 洗脫液洗脫----連接，16度，約3-4h----轉(zhuǎn)化，熱激時(shí)，42度，40 s 即可----后培養(yǎng)，加200 ul 液體LB ，37度靜止培養(yǎng) 1 h----取200 ul 涂氨芐。 |
5樓2014-07-25 13:11:27
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