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鬼羽帝魂木蟲 (著名寫手)
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[求助]
大片段連接大載體難以連接的問題 已有4人參與
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最近做實驗，大片段連接大載體。 載體、片段用相同的酶雙酶切后回收，再連接。 （1）載體10000、片段4000，（2）載體12700、片段4334，改變體系做了3次。 第一次（1）長了1個，（2）長了好多，但是酶切驗證都不對 第二次，第三次都沒長單克隆。 連接時載體：片段為1:5，最大試過1:10，16度過夜或者8小時以上。 甚至，我連接酶都加了2ul（10ul的體系） 卡住了我在這，求指導，謝謝。 |
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2014-09-04 19:29:06
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2014-09-04 19:29:06
| 對于大片段連接的確是一個很難的問題，我在這上面也受了很多苦頭，先把自己的經(jīng)驗奉上，1，對載體與基因片段進行分析，如GC含量，二級結(jié)構(gòu)，大片段之所以連接不上很有可能是片段大形成螺旋結(jié)構(gòu)降低連接碰撞機率，建議在加入連接酶的同時加入拓樸異構(gòu)酶（promega有賣），可以提高陽性率;2，可采取分段連接的策略，在載體上尋找一個大小合適單酶切從位點切下，進行三片段連接，我用這個方法連接過幾個大片段都好用，不過平端的話得驗證連接順序有點麻煩;3,運用IN-Fusion技術進行無縫連接，但對于大片段PCR擴增時需要高保真酶，由于PCR有一定的錯誤幾率，我一般是先將PCR產(chǎn)物連接克隆載體，測序正確后，在克隆載體上切下來去IN-Fusion連接，效果也不錯 |
7樓2014-09-04 10:38:25
2樓2014-09-04 09:13:23
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4樓2014-09-04 09:52:00
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