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[求助]
長片段連接問題
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目前，正在做長片段的表達(dá)，但連接PBR322載體一直未能找到陽性克隆，現(xiàn)求助各位有經(jīng)驗(yàn)的大神幫助。 我的目的片段已經(jīng)連接到T載體上，目的片段6.5kb，雙酶切后，跑電泳后很容易區(qū)分開來。但PBR322載體雙酶切后一段長3.9kb左右，一段0.4kb。但載體雙酶切后，取5微升跑膠發(fā)現(xiàn)，酶切不完全，酶切時(shí)間有將近4小時(shí)，但在回收膠上，根本分不開，所以切膠回收的話，肯定將單酶切產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物都回收了。在與目的片段連接16度過夜，挑選到的全是載體自連，根本發(fā)現(xiàn)不了陽性克隆。我覺得，即使含有單酶切的載體，（但是按之前跑膠的亮度來看，單酶切與雙酶切的產(chǎn)物的亮度基本一致），也存在雙酶切的產(chǎn)物與目的基因連接的概率，我的目的片段與載體的比例，做過1:3,1:5,1:8的不同濃度，那么現(xiàn)在我是不是應(yīng)該采用分步酶切（采用酶自身所帶的buffer），這樣是不是可以優(yōu)化到酶的最大活性，其中有一個(gè)酶切效果在通用buffer中活性也很高，我就懷疑是另外一個(gè)酶在通用buffer中，酶切活性低，而導(dǎo)致酶切的不完全？但是，這又回到了前面的問題，既然有那么多的雙酶切產(chǎn)物也在其中，為什么我挑了多個(gè)克隆，怎么就完全是假陽性呢，另外，對(duì)于做過長片段的連接，有經(jīng)驗(yàn)的前輩希望傳授一下。 |
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10樓2014-05-22 09:25:52
bullfrog325
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2樓2013-10-17 04:28:05
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雙酶切的體系：連接在T載體上的目的片段 20ul 10×buffer 5ul sal I 2ul NheI 2ul pdw 21ul 載體PBR322 25UL 10×buffer 5ul sal I 2ul NheI 2ul pdw 16ul 提取質(zhì)粒跑電泳發(fā)現(xiàn)載體的條帶明顯比含有目的片段的載體暗，但由于實(shí)驗(yàn)室測(cè)量DNA的紫外分光光度計(jì)感覺測(cè)量的很不準(zhǔn)確，堿裂解發(fā)提取的質(zhì)粒濃度一般都顯示達(dá)到4-5000ng/ul，雙酶切電泳后發(fā)現(xiàn)目的片段很亮，但載體卻不怎么亮。 謝謝您的回復(fù)。 我現(xiàn)在擔(dān)心的一個(gè)問題是，是不是有這樣一種情況，目的片段與載體連接過后，達(dá)到10.5kb,這會(huì)不會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化過程中出現(xiàn)問題，我直接轉(zhuǎn)化到我的工程菌里面，自制的化學(xué)感受態(tài)，但既然能長出那么多載體自連，我覺得感受態(tài)應(yīng)該沒問題，還有就是長片段連接的時(shí)間一般多少為好？ |
3樓2013-10-17 22:34:25
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4樓2013-10-17 23:18:31
5樓2013-10-18 10:02:41
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今天做了將載體的量為5ul的，總體積為25ul的體系的預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果依舊很不理想，酶的量為1ul。奇怪的一個(gè)現(xiàn)象的為原來做過10ul體系的預(yù)實(shí)驗(yàn)，加的是5ul的質(zhì)粒，0.5的酶，用Nhe I酶自帶的buffer，跑電泳發(fā)現(xiàn)單酶切效果不錯(cuò)，但是昨天做50ul的體系，采用分步酶切，第一步用Nhe I 酶切后用乙醇沉淀回收，二次酶切后用試劑盒回收，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卻又沒酶切完全，糾結(jié)。我現(xiàn)在是不是應(yīng)該想辦法盡可能的將單酶切產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物通過回收膠將其分離開來，提高膠的濃度，增加膠的長度，使相差400bp的兩條帶盡可能的分離開來，盡可能的少的回收雙酶切產(chǎn)物。 |
6樓2013-10-18 21:22:28
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8樓2014-05-20 12:55:36
9樓2014-05-22 09:22:23
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