 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 2658 | 回復(fù): 14 | ||
[求助]
長片段連接問題
|
||
|
目前，正在做長片段的表達，但連接PBR322載體一直未能找到陽性克隆，現(xiàn)求助各位有經(jīng)驗的大神幫助。 我的目的片段已經(jīng)連接到T載體上，目的片段6.5kb，雙酶切后，跑電泳后很容易區(qū)分開來。但PBR322載體雙酶切后一段長3.9kb左右，一段0.4kb。但載體雙酶切后，取5微升跑膠發(fā)現(xiàn)，酶切不完全，酶切時間有將近4小時，但在回收膠上，根本分不開，所以切膠回收的話，肯定將單酶切產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物都回收了。在與目的片段連接16度過夜，挑選到的全是載體自連，根本發(fā)現(xiàn)不了陽性克隆。我覺得，即使含有單酶切的載體，（但是按之前跑膠的亮度來看，單酶切與雙酶切的產(chǎn)物的亮度基本一致），也存在雙酶切的產(chǎn)物與目的基因連接的概率，我的目的片段與載體的比例，做過1:3,1:5,1:8的不同濃度，那么現(xiàn)在我是不是應(yīng)該采用分步酶切（采用酶自身所帶的buffer），這樣是不是可以優(yōu)化到酶的最大活性，其中有一個酶切效果在通用buffer中活性也很高，我就懷疑是另外一個酶在通用buffer中，酶切活性低，而導致酶切的不完全？但是，這又回到了前面的問題，既然有那么多的雙酶切產(chǎn)物也在其中，為什么我挑了多個克隆，怎么就完全是假陽性呢，另外，對于做過長片段的連接，有經(jīng)驗的前輩希望傳授一下。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
求材料調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
085600材料與化工
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
085600材料與化工調(diào)劑 324分
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
286求調(diào)劑
已經(jīng)有9人回復(fù)
-
焦慮
已經(jīng)有12人回復(fù)
-
344求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
266求調(diào)劑
已經(jīng)有9人回復(fù)
-
化學工程321分求調(diào)劑
已經(jīng)有18人回復(fù)
-
314求調(diào)劑
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
08工科 320總分 求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- PCR大片段問題
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 片段總是連不到T載體上
已經(jīng)有22人回復(fù)
- DNA片段連接到載體上都有什么方法
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 2.7Kb的片段連接問題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- DNA片段化問題
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 兩個基因片段的連接問題？
已經(jīng)有11人回復(fù)
- PCR產(chǎn)物純化后酶切，連接
已經(jīng)有28人回復(fù)
- pET28a雙酶切后連接目的基因，什么也不長。。。
已經(jīng)有23人回復(fù)
- 單酶切的大片段連接轉(zhuǎn)化及多個片段的連接轉(zhuǎn)化問題
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 載體和酶切片段連接的問題
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 長片段連接問題
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 連接前等摩爾加入兩個片段的問題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 大片段連接問題
已經(jīng)有20人回復(fù)
- 長片段DNA如何連接載體
已經(jīng)有21人回復(fù)
- 回收片段連接以后為什么變短了？在線等
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 求助連接反應(yīng)中的問題，謝謝!
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助/交流】連接轉(zhuǎn)化長菌有質(zhì)粒，但是沒有目的片段，怎么回事？？
已經(jīng)有20人回復(fù)
- 【求助/交流】超大片段連接問題
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 【求助/交流】大片段連接轉(zhuǎn)化成功與否問題
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 【求助/交流】長片段的連接轉(zhuǎn)化
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于PCR克隆片段連接問題
已經(jīng)有4人回復(fù)
10樓2014-05-22 09:25:52
bullfrog325
木蟲 (正式寫手)
- BioEPI: 1
- 應(yīng)助: 193 (高中生)
- 金幣: 2880.3
- 散金: 200
- 紅花: 24
- 帖子: 744
- 在線: 269.5小時
- 蟲號: 1864929
- 注冊: 2012-06-20
2樓2013-10-17 04:28:05
|
雙酶切的體系：連接在T載體上的目的片段 20ul 10×buffer 5ul sal I 2ul NheI 2ul pdw 21ul 載體PBR322 25UL 10×buffer 5ul sal I 2ul NheI 2ul pdw 16ul 提取質(zhì)粒跑電泳發(fā)現(xiàn)載體的條帶明顯比含有目的片段的載體暗，但由于實驗室測量DNA的紫外分光光度計感覺測量的很不準確，堿裂解發(fā)提取的質(zhì)粒濃度一般都顯示達到4-5000ng/ul，雙酶切電泳后發(fā)現(xiàn)目的片段很亮，但載體卻不怎么亮。 謝謝您的回復(fù)。 我現(xiàn)在擔心的一個問題是，是不是有這樣一種情況，目的片段與載體連接過后，達到10.5kb,這會不會導致轉(zhuǎn)化過程中出現(xiàn)問題，我直接轉(zhuǎn)化到我的工程菌里面，自制的化學感受態(tài)，但既然能長出那么多載體自連，我覺得感受態(tài)應(yīng)該沒問題，還有就是長片段連接的時間一般多少為好？ |
3樓2013-10-17 22:34:25
bullfrog325
木蟲 (正式寫手)
- BioEPI: 1
- 應(yīng)助: 193 (高中生)
- 金幣: 2880.3
- 散金: 200
- 紅花: 24
- 帖子: 744
- 在線: 269.5小時
- 蟲號: 1864929
- 注冊: 2012-06-20
4樓2013-10-17 23:18:31
5樓2013-10-18 10:02:41
|
今天做了將載體的量為5ul的，總體積為25ul的體系的預(yù)實驗，結(jié)果依舊很不理想，酶的量為1ul。奇怪的一個現(xiàn)象的為原來做過10ul體系的預(yù)實驗，加的是5ul的質(zhì)粒，0.5的酶，用Nhe I酶自帶的buffer，跑電泳發(fā)現(xiàn)單酶切效果不錯，但是昨天做50ul的體系，采用分步酶切，第一步用Nhe I 酶切后用乙醇沉淀回收，二次酶切后用試劑盒回收，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卻又沒酶切完全，糾結(jié)。我現(xiàn)在是不是應(yīng)該想辦法盡可能的將單酶切產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物通過回收膠將其分離開來，提高膠的濃度，增加膠的長度，使相差400bp的兩條帶盡可能的分離開來，盡可能的少的回收雙酶切產(chǎn)物。 |
6樓2013-10-18 21:22:28
7樓2013-10-19 16:57:19
笑笑打dota
金蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1135.5
- 帖子: 51
- 在線: 297.8小時
- 蟲號: 2852767
- 注冊: 2013-12-06
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
8樓2014-05-20 12:55:36
9樓2014-05-22 09:22:23
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 白色毛衣 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +6 | 26研0 2026-03-15 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研]
 0854，計算機類招收調(diào)劑
+3
|
胡辣湯放糖 2026-03-15 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 280求調(diào)劑 +6 | 咕嚕曉曉 2026-03-18 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿中國海洋大學，生物學，301分，求調(diào)劑 +3 | 1孫悟空 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 工科材料085601 279求調(diào)劑 +6 | 困于星晨 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 有沒有道鐵/土木的想調(diào)劑南林，給自己招師弟中～ +3 | TqlXswl 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 285化工學碩求調(diào)劑（081700） +9 | 柴郡貓_ 2026-03-12 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 267一志愿南京工業(yè)大學0817化工求調(diào)劑 +6 | SUICHILD 2026-03-12 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 278求調(diào)劑 +3 | Yy7400 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 333求調(diào)劑 +3 | 文思客 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0703 物理化學調(diào)劑 +3 | 我可以上岸的對?/a> 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研]
機械專碩調(diào)劑
+3
|
笨笨兔子 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 本科南京大學一志愿川大藥學327 +3 | 麥田耕者 2026-03-14 | 3/150 |
|
|
|
[基金申請]
有必要更換申報口嗎
 20+3
|
fannyamoy 2026-03-11 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料與化工求調(diào)劑一志愿 985 總分 295 +8 | dream…… 2026-03-12 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 26調(diào)劑/材料/英一數(shù)二/總分289/已過A區(qū)線 +6 | 步川酷紫123 2026-03-13 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 考研調(diào)劑 +4 | 芬達46 2026-03-12 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 工科材料085601 279求調(diào)劑 +8 | 困于星晨 2026-03-12 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +3 | 李政瑩 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑，材料、化工皆可 +8 | 蘇打水7777 2026-03-11 | 10/500 |
|