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chenchenand新蟲 (小有名氣)
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[求助]
急求！大容量載體與片段連接問題 已有2人參與
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現(xiàn)手上有一質(zhì)粒，大小為10kb，紅霉素抗性。沒有全序列，只有其編碼的一個基因的序列，大小約為1.5kb。測序發(fā)現(xiàn)，該基因的一個堿基發(fā)生了點突變，導(dǎo)致編碼蛋白的活性很低。為了解決這個問題，我通過HindIII和KpnI兩個酶將這段序列切下來，連接到puc 19這個載體上。后通過點突變試劑盒完成了該堿基的突變。后再通過上述兩個酶把該基因的片段連回上述大質(zhì)粒，連接轉(zhuǎn)化了有2個月，長的菌都是假陽性（大腸桿菌對紅霉素有一定的耐受性）。酶切后的載體經(jīng)純化后濃度為30ng/微升，1.5kb的片段純化后濃度為40ng/微升，連接體系10微升，20微升都試過了，各種比例（載體：片段=1:3-6）都試過了，采用電轉(zhuǎn)方式，感受態(tài)是dh5a，都沒有陽性克隆長出。咨詢了一些人，有些人認為大載體連接，我這個濃度太低了，要切膠純化后達到幾百ng/微升才行；有些人建議連接體系放大些，比如50微升，連接后再用乙醇濃縮等等。這些都準備試一下，還請大家針對我這個問題，提提建議， ，謝謝！ |
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luwei13566
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
chenchenand: 金幣+5, ★★★很有幫助, 謝謝牛人指導(dǎo)，我會按照你的說法再試試。 2014-07-18 08:44:08
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2014-07-18 10:30:09
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西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵回帖交流 2014-07-18 10:30:09
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看了你的情況有以下幾點看法 1.你轉(zhuǎn)化后的假陽性是含有空載質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子還是菌里面啥質(zhì)粒都沒有就能長出來。如果是前者那很有可能你對載體的酶切不完全，那在酶切上下工夫，比如延長切割時間或者分步酶切。如果是后者的話，那你得做個紅霉素濃度梯度的實驗，設(shè)置不同抗生素濃度的平板，一批平板涂含質(zhì)粒的菌，一批涂不含質(zhì)粒的菌，最好的結(jié)果是一定濃度的抗生素能完全抑制野生菌而又不影響帶質(zhì)粒菌轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)�？股氐暮Y選效果很重要，如果抗生素效果不行那你后期的轉(zhuǎn)化后篩選會非常困難。 2.你載體明顯不夠，一般連接載體添加量得有0.02pmol，大約相當于4kb的質(zhì)粒50ng，基因大于等于0.06pmol，大約相當于1kb的基因37.5ng以上，你的質(zhì)粒那么大那單位質(zhì)量的摩爾數(shù)肯定小，你的質(zhì)粒和基因的濃度都不高，整個體系中你還要顧及基因和載體的比例因此你的載體肯定沒有加夠，抗生素篩選效果再不好的話，自然很多的假陽性 3.你那個基因和載體的比例是質(zhì)量比嗎？如果是質(zhì)量比的話那你的基因和載體的摩爾比遠高于10:1，你說的那個1:3——1:6是指的摩爾比，單純的質(zhì)量比沒有任何意義。一般來說基因和載體的摩爾比在3:1到10:1之間，過高的比例不利于正確的連接。 4.因為你的載體還是很大的，酶連可能確實不好連，但是handIII的粘性末端連接效率很高，因此酶連最好分兩步走，首先用小體系（10ul）16度過夜酶連或者酶連20h，之后加水稀釋補加T4酶和buffer到20ul—50ul進行二次酶連，酶連完不需要濃縮取適當體積進行轉(zhuǎn)化即可。 |
2樓2014-07-18 05:45:09
chenchenand
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4樓2014-07-18 20:51:58
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5樓2014-07-19 10:06:01
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6樓2015-07-29 10:02:04
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