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chenchenand新蟲 (小有名氣)
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[求助]
急求！大容量載體與片段連接問題 已有2人參與
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現(xiàn)手上有一質(zhì)粒，大小為10kb，紅霉素抗性。沒有全序列，只有其編碼的一個(gè)基因的序列，大小約為1.5kb。測(cè)序發(fā)現(xiàn)，該基因的一個(gè)堿基發(fā)生了點(diǎn)突變，導(dǎo)致編碼蛋白的活性很低。為了解決這個(gè)問題，我通過HindIII和KpnI兩個(gè)酶將這段序列切下來，連接到puc 19這個(gè)載體上。后通過點(diǎn)突變?cè)噭┖型瓿闪嗽搲A基的突變。后再通過上述兩個(gè)酶把該基因的片段連回上述大質(zhì)粒，連接轉(zhuǎn)化了有2個(gè)月，長(zhǎng)的菌都是假陽性（大腸桿菌對(duì)紅霉素有一定的耐受性）。酶切后的載體經(jīng)純化后濃度為30ng/微升，1.5kb的片段純化后濃度為40ng/微升，連接體系10微升，20微升都試過了，各種比例（載體：片段=1:3-6）都試過了，采用電轉(zhuǎn)方式，感受態(tài)是dh5a，都沒有陽性克隆長(zhǎng)出。咨詢了一些人，有些人認(rèn)為大載體連接，我這個(gè)濃度太低了，要切膠純化后達(dá)到幾百ng/微升才行；有些人建議連接體系放大些，比如50微升，連接后再用乙醇濃縮等等。這些都準(zhǔn)備試一下，還請(qǐng)大家針對(duì)我這個(gè)問題，提提建議， ，謝謝！ |
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luwei13566
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
chenchenand: 金幣+5, ★★★很有幫助, 謝謝牛人指導(dǎo)，我會(huì)按照你的說法再試試。 2014-07-18 08:44:08
西門吹雪170: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-07-18 10:30:09
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看了你的情況有以下幾點(diǎn)看法 1.你轉(zhuǎn)化后的假陽性是含有空載質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子還是菌里面啥質(zhì)粒都沒有就能長(zhǎng)出來。如果是前者那很有可能你對(duì)載體的酶切不完全，那在酶切上下工夫，比如延長(zhǎng)切割時(shí)間或者分步酶切。如果是后者的話，那你得做個(gè)紅霉素濃度梯度的實(shí)驗(yàn)，設(shè)置不同抗生素濃度的平板，一批平板涂含質(zhì)粒的菌，一批涂不含質(zhì)粒的菌，最好的結(jié)果是一定濃度的抗生素能完全抑制野生菌而又不影響帶質(zhì)粒菌轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)�？股氐暮Y選效果很重要，如果抗生素效果不行那你后期的轉(zhuǎn)化后篩選會(huì)非常困難。 2.你載體明顯不夠，一般連接載體添加量得有0.02pmol，大約相當(dāng)于4kb的質(zhì)粒50ng，基因大于等于0.06pmol，大約相當(dāng)于1kb的基因37.5ng以上，你的質(zhì)粒那么大那單位質(zhì)量的摩爾數(shù)肯定小，你的質(zhì)粒和基因的濃度都不高，整個(gè)體系中你還要顧及基因和載體的比例因此你的載體肯定沒有加夠，抗生素篩選效果再不好的話，自然很多的假陽性 3.你那個(gè)基因和載體的比例是質(zhì)量比嗎？如果是質(zhì)量比的話那你的基因和載體的摩爾比遠(yuǎn)高于10:1，你說的那個(gè)1:3——1:6是指的摩爾比，單純的質(zhì)量比沒有任何意義。一般來說基因和載體的摩爾比在3:1到10:1之間，過高的比例不利于正確的連接。 4.因?yàn)槟愕妮d體還是很大的，酶連可能確實(shí)不好連，但是handIII的粘性末端連接效率很高，因此酶連最好分兩步走，首先用小體系（10ul）16度過夜酶連或者酶連20h，之后加水稀釋補(bǔ)加T4酶和buffer到20ul—50ul進(jìn)行二次酶連，酶連完不需要濃縮取適當(dāng)體積進(jìn)行轉(zhuǎn)化即可。 |
2樓2014-07-18 05:45:09
chenchenand
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3樓2014-07-18 08:53:04
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4樓2014-07-18 20:51:58
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6樓2015-07-29 10:02:04
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