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xujingyuanxu銅蟲 (正式寫手)
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[求助]
請問關于實時熒光定量pcr實驗中重復次數(shù)的問題
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想向各位朋友們請教一下，在發(fā)文章時，基因表達的這一部分用rtqpcr做的話是不是每個樣品最少三個生物學重復�。棵總�生物學重復要做4-6個重復孔么？ 其次，是不是要測的每個基因都要做一次標曲啊？謝謝 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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atlanticwi
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一般做處理，檢測基因表達變化的體系，生物學重復并不等于實驗重復，我們自己的標準是一次實驗重復內(nèi)包含兩個生物學重復，即處理同樣的東西兩份，也有兩個相應的對照。qRT-PCR的技術重復只是檢測加樣以及實驗系統(tǒng)的誤差。并不算在真正意義上的與實驗相關的重復。所以一般直接取平均值用（除非機械重復很爛，這時候去掉一個離群值，留另兩個做平均，利用平均值來相互比對，如果三個值分散太大，那說明實驗操作問題，整板實驗結(jié)果就不可信），同理生物學重復也可以取平均值用，但是會帶有自己的SD，你再做三個實驗重復，就是利用每一次實驗中的三個生物學重復的平均值相互對比，帶有自己的SEM，所以問題就來了，誤差是可以層層傳遞的（具體我也沒仔細去算過)，真正嚴格的實驗結(jié)果去計算顯示出來是非常復雜的。同樣誤差棒也賊大了。 所以就折中用趨勢來討論。實驗以一次實驗的代表性結(jié)果來表示，Mean代表一次實驗內(nèi)的2~3次生物學重復，+/-SD就可以。 第二個問題，基因表達分析，通常用相對定量（2-delta deltaCt法來算），我們不用標曲。 |
4樓2016-05-05 18:14:21
atlanticwi
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.................嗯 對于qRT-PCR來說，每次一個反應必須有三個技術重復，這是絕對不能少的。 一般做處理，需要有生物學重復，我們一般是兩個 至于實驗重復，一般要求三次，看情況來做 不管你怎么做，Mean+/-SD (SD都應該代表的是生物學重復，而不能用技術重復來糊弄) 如果你實驗重復較好，可以酌情做實驗重復間的Mean+/-SEM 但如果實驗重復之間趨勢一致，但基因受調(diào)控的程度波動太大，建議圖做成一次實驗重復內(nèi)的生物學重復間的Mean+/-SD，然后注明"進行了三次實驗，得到相似結(jié)果，放入的實驗結(jié)果為代表性的........"類似話語 個人意見，如有說錯，請指正 |
2樓2016-05-05 13:15:32
xujingyuanxu
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謝謝你的解答！我在看文獻時，別人在圖注中寫明了是3個生物學重復，可是沒注意到過有寫實驗重復次數(shù)的啊，實驗重復次數(shù)也會有要求么？按你的解答，我是不是可以這樣理解，例如說：一次實驗，培養(yǎng)三份植物，測定一個基因的話就要有（3*3）九次技術重復，如果再來三次實驗重復的話就是（3*9）27次了？ 還有一個問題想請教：是不是測每個不同基因的表達差異時都要做各自的標曲�。� 小白求指教 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2016-05-05 13:52:20
xujingyuanxu
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大神，你好！非常感謝你耐心的解答！我想做植物不同發(fā)育階段的某個基因表達變化，分成好多階段，起碼5個。沒有特殊處理，那么我這里面的CK組該怎么設置呢？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
5樓2016-05-05 22:32:10
atlanticwi
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根據(jù)你的描述，就不會有Ck設置，每個樣品中某一基因減掉該樣品的內(nèi)參對照（2^deltaCt法）直接作圖即可。 如果必須要2^-deltadeltaCt法來做，找你想要作為對照的那個發(fā)育階段樣品來做基準（也就等同處理實驗中的Ck），這個樣品的基因表達值就會被Normalize到1（2^自己Ct-自己Ct）其他階段的樣品就會以它為參照，成為相對表達量（Y軸的寫法也會變） 問題在內(nèi)參上，不能跟隨發(fā)育時期有太大變化。 另外可以不設生物學重復，直接實驗重復即可，據(jù)你所說的情況，在我的理解范圍內(nèi)，如果不涉及處理條件。生物學重復和實驗重復是等同的。重復三次保證趨勢一致即可。表達量上接近更好 個人理解，如有錯誤，歡迎指出 |
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xujingyuanxu6樓2016-05-06 00:22:45
jingyu90217
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這要看你的實驗設計具體如何定義不同發(fā)育階段。比如我們有的時候會把干種子作為對照�；蛘甙殉雒绲哪翘熳鳛槌跏紝φ�。然后同一個處理下采集4個樣品。即4個生物學重復。再做2次技術重復。最后得到8個值�？梢匀∩岬羝畲蟮摹５辽俦Ａ�6個做圖和數(shù)據(jù)分析。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
7樓2016-05-06 02:04:14
xujingyuanxu
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8樓2016-05-06 07:09:20
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9樓2016-05-06 07:10:18
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一般可以三個生物學重復，每次4個重復孔，技術重復就看你操作了，如果結(jié)果很好的話，就不需要技術重復吧。至于標��？應該是指引物的梯度吧？理論上是要的，但實際中很多人往往沒有做…… 只要結(jié)果是好的就默認引物可以… 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
10樓2016-05-06 08:43:00
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