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xujingyuanxu銅蟲 (正式寫手)
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[求助]
請(qǐng)問關(guān)于實(shí)時(shí)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)中重復(fù)次數(shù)的問題
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想向各位朋友們請(qǐng)教一下，在發(fā)文章時(shí)，基因表達(dá)的這一部分用rtqpcr做的話是不是每個(gè)樣品最少三個(gè)生物學(xué)重復(fù)��？每個(gè)生物學(xué)重復(fù)要做4-6個(gè)重復(fù)孔么？ 其次，是不是要測(cè)的每個(gè)基因都要做一次標(biāo)曲啊？謝謝 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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atlanticwi
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根據(jù)你的描述，就不會(huì)有Ck設(shè)置，每個(gè)樣品中某一基因減掉該樣品的內(nèi)參對(duì)照（2^deltaCt法）直接作圖即可。 如果必須要2^-deltadeltaCt法來做，找你想要作為對(duì)照的那個(gè)發(fā)育階段樣品來做基準(zhǔn)（也就等同處理實(shí)驗(yàn)中的Ck），這個(gè)樣品的基因表達(dá)值就會(huì)被Normalize到1（2^自己Ct-自己Ct）其他階段的樣品就會(huì)以它為參照，成為相對(duì)表達(dá)量（Y軸的寫法也會(huì)變） 問題在內(nèi)參上，不能跟隨發(fā)育時(shí)期有太大變化。 另外可以不設(shè)生物學(xué)重復(fù)，直接實(shí)驗(yàn)重復(fù)即可，據(jù)你所說的情況，在我的理解范圍內(nèi)，如果不涉及處理?xiàng)l件。生物學(xué)重復(fù)和實(shí)驗(yàn)重復(fù)是等同的。重復(fù)三次保證趨勢(shì)一致即可。表達(dá)量上接近更好 個(gè)人理解，如有錯(cuò)誤，歡迎指出 |
xujingyuanxu6樓2016-05-06 00:22:45
atlanticwi
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.................嗯 對(duì)于qRT-PCR來說，每次一個(gè)反應(yīng)必須有三個(gè)技術(shù)重復(fù)，這是絕對(duì)不能少的。 一般做處理，需要有生物學(xué)重復(fù)，我們一般是兩個(gè) 至于實(shí)驗(yàn)重復(fù)，一般要求三次，看情況來做 不管你怎么做，Mean+/-SD (SD都應(yīng)該代表的是生物學(xué)重復(fù)，而不能用技術(shù)重復(fù)來糊弄) 如果你實(shí)驗(yàn)重復(fù)較好，可以酌情做實(shí)驗(yàn)重復(fù)間的Mean+/-SEM 但如果實(shí)驗(yàn)重復(fù)之間趨勢(shì)一致，但基因受調(diào)控的程度波動(dòng)太大，建議圖做成一次實(shí)驗(yàn)重復(fù)內(nèi)的生物學(xué)重復(fù)間的Mean+/-SD，然后注明"進(jìn)行了三次實(shí)驗(yàn)，得到相似結(jié)果，放入的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為代表性的........"類似話語(yǔ) 個(gè)人意見，如有說錯(cuò)，請(qǐng)指正 |
2樓2016-05-05 13:15:32
xujingyuanxu
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謝謝你的解答！我在看文獻(xiàn)時(shí)，別人在圖注中寫明了是3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，可是沒注意到過有寫實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)的啊，實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)也會(huì)有要求么？按你的解答，我是不是可以這樣理解，例如說：一次實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)三份植物，測(cè)定一個(gè)基因的話就要有（3*3）九次技術(shù)重復(fù)，如果再來三次實(shí)驗(yàn)重復(fù)的話就是（3*9）27次了？ 還有一個(gè)問題想請(qǐng)教：是不是測(cè)每個(gè)不同基因的表達(dá)差異時(shí)都要做各自的標(biāo)曲��？ 小白求指教 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2016-05-05 13:52:20
atlanticwi
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一般做處理，檢測(cè)基因表達(dá)變化的體系，生物學(xué)重復(fù)并不等于實(shí)驗(yàn)重復(fù)，我們自己的標(biāo)準(zhǔn)是一次實(shí)驗(yàn)重復(fù)內(nèi)包含兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)，即處理同樣的東西兩份，也有兩個(gè)相應(yīng)的對(duì)照。qRT-PCR的技術(shù)重復(fù)只是檢測(cè)加樣以及實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的誤差。并不算在真正意義上的與實(shí)驗(yàn)相關(guān)的重復(fù)。所以一般直接取平均值用（除非機(jī)械重復(fù)很爛，這時(shí)候去掉一個(gè)離群值，留另兩個(gè)做平均，利用平均值來相互比對(duì)，如果三個(gè)值分散太大，那說明實(shí)驗(yàn)操作問題，整板實(shí)驗(yàn)結(jié)果就不可信），同理生物學(xué)重復(fù)也可以取平均值用，但是會(huì)帶有自己的SD，你再做三個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)，就是利用每一次實(shí)驗(yàn)中的三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值相互對(duì)比，帶有自己的SEM，所以問題就來了，誤差是可以層層傳遞的（具體我也沒仔細(xì)去算過)，真正嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)結(jié)果去計(jì)算顯示出來是非常復(fù)雜的。同樣誤差棒也賊大了。 所以就折中用趨勢(shì)來討論。實(shí)驗(yàn)以一次實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果來表示，Mean代表一次實(shí)驗(yàn)內(nèi)的2~3次生物學(xué)重復(fù)，+/-SD就可以。 第二個(gè)問題，基因表達(dá)分析，通常用相對(duì)定量（2-delta deltaCt法來算），我們不用標(biāo)曲。 |
4樓2016-05-05 18:14:21
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