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xujingyuanxu銅蟲 (正式寫手)
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[求助]
請問關于實時熒光定量pcr實驗中重復次數(shù)的問題
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想向各位朋友們請教一下，在發(fā)文章時，基因表達的這一部分用rtqpcr做的話是不是每個樣品最少三個生物學重復啊？每個生物學重復要做4-6個重復孔么？ 其次，是不是要測的每個基因都要做一次標曲��？謝謝 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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xujingyuanxu
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8樓2016-05-06 07:09:20
atlanticwi
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.................嗯 對于qRT-PCR來說，每次一個反應必須有三個技術重復，這是絕對不能少的。 一般做處理，需要有生物學重復，我們一般是兩個 至于實驗重復，一般要求三次，看情況來做 不管你怎么做，Mean+/-SD (SD都應該代表的是生物學重復，而不能用技術重復來糊弄) 如果你實驗重復較好，可以酌情做實驗重復間的Mean+/-SEM 但如果實驗重復之間趨勢一致，但基因受調控的程度波動太大，建議圖做成一次實驗重復內的生物學重復間的Mean+/-SD，然后注明"進行了三次實驗，得到相似結果，放入的實驗結果為代表性的........"類似話語 個人意見，如有說錯，請指正 |
2樓2016-05-05 13:15:32
xujingyuanxu
銅蟲 (正式寫手)
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謝謝你的解答！我在看文獻時，別人在圖注中寫明了是3個生物學重復，可是沒注意到過有寫實驗重復次數(shù)的啊，實驗重復次數(shù)也會有要求么？按你的解答，我是不是可以這樣理解，例如說：一次實驗，培養(yǎng)三份植物，測定一個基因的話就要有（3*3）九次技術重復，如果再來三次實驗重復的話就是（3*9）27次了？ 還有一個問題想請教：是不是測每個不同基因的表達差異時都要做各自的標曲啊？ 小白求指教 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2016-05-05 13:52:20
atlanticwi
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一般做處理，檢測基因表達變化的體系，生物學重復并不等于實驗重復，我們自己的標準是一次實驗重復內包含兩個生物學重復，即處理同樣的東西兩份，也有兩個相應的對照。qRT-PCR的技術重復只是檢測加樣以及實驗系統(tǒng)的誤差。并不算在真正意義上的與實驗相關的重復。所以一般直接取平均值用（除非機械重復很爛，這時候去掉一個離群值，留另兩個做平均，利用平均值來相互比對，如果三個值分散太大，那說明實驗操作問題，整板實驗結果就不可信），同理生物學重復也可以取平均值用，但是會帶有自己的SD，你再做三個實驗重復，就是利用每一次實驗中的三個生物學重復的平均值相互對比，帶有自己的SEM，所以問題就來了，誤差是可以層層傳遞的（具體我也沒仔細去算過)，真正嚴格的實驗結果去計算顯示出來是非常復雜的。同樣誤差棒也賊大了。 所以就折中用趨勢來討論。實驗以一次實驗的代表性結果來表示，Mean代表一次實驗內的2~3次生物學重復，+/-SD就可以。 第二個問題，基因表達分析，通常用相對定量（2-delta deltaCt法來算），我們不用標曲。 |
4樓2016-05-05 18:14:21
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