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1257851289新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
PCR沒(méi)有目的條帶，引物二聚體很明顯 已有1人參與
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程序是95℃5min 95℃30s 60℃30s 72℃5min 32個(gè)循環(huán) 72℃延伸7min，目的條帶4200bp，第一次很亮，后來(lái)帶就不明顯了，送原液測(cè)序不行，現(xiàn)在帶都沒(méi)了。求助該怎么改進(jìn) 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門吹雪170: 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2016-08-12 22:32:55
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您好！PCR的問(wèn)題向來(lái)號(hào)稱最簡(jiǎn)單也最復(fù)雜。您這種情況，從您“第一次很亮”的描述來(lái)看，引物是匹配的，條件是可以的，后面重復(fù)實(shí)驗(yàn)擴(kuò)不出來(lái)，則有可能是引物降解、模板降解、酶活失效等原因。個(gè)人認(rèn)為模板降解的可能性最大。 但是如果“第一次很亮”是一種贗像，那您就需要仔細(xì)排查引物的設(shè)計(jì)，擴(kuò)增條件的設(shè)定，模板的質(zhì)量等所有體系因素了。通常的，換引物比較常見(jiàn)；擴(kuò)增不出來(lái)時(shí)，降低退火溫度到50℃也是可以嘗試的；當(dāng)然，模板的質(zhì)量還是要討論的，可以跑下膠，測(cè)下濃度什么的。通常酶失活的情況少見(jiàn)，但有條件的話，找一管陽(yáng)性的酶試試，說(shuō)不定有幫助呢。 總之，要設(shè)計(jì)對(duì)比實(shí)驗(yàn)對(duì)各種因素排查，有問(wèn)題可以再交流。祝好運(yùn)！ |
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2樓2016-07-20 16:58:53
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3樓2016-07-20 20:06:19
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9樓2016-07-20 22:33:08
10樓2016-07-21 03:28:20
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