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卡西西VS鳴人金蟲 (小有名氣)
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[求助]
連接載體轉(zhuǎn)化后挑單菌落，菌落pcr擴出條帶，但是搖菌搖不起來 已有3人參與
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載體是連接有EGFP的瞬時表達載體，有氨芐抗性。轉(zhuǎn)化到DH5α中，涂含氨芐的平板。倒置培養(yǎng)12個小時候未見菌落，但是17個小時候有菌落，且密度不是很大，單菌落數(shù)不多不少的樣子。我先是挑單菌落搖菌，準(zhǔn)備做菌液pcr，但是37°C轉(zhuǎn)速200培養(yǎng)過夜之后LB培養(yǎng)基仍然是清亮的，沒有任何菌生長。再挑單菌落，換了別人配的LB震蕩培養(yǎng)，仍然是沒有搖起來。最后我挑單菌落加到20μl的水中做菌落pcr，設(shè)置了空白對照，pcr結(jié)果顯示空白對照沒有條帶，其它菌落pcr只有兩個未擴出條帶。將pcr條帶最亮的幾管分別加到4mlLB培養(yǎng)基中，再加入4μl氨芐，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。最后居然還是沒有菌落生長，培養(yǎng)基一片清亮······ 我在網(wǎng)上查到說，挑單菌落的時候可能挑到平板上未干的連接液，連接液里可能含有未連接到載體上的目的片段，所以pcr可以擴出條帶。但是我很確定我挑到了菌落，肉眼看到菌落慢慢的分散開來然后水變渾濁。即使是空載，搖菌應(yīng)該也能搖起來。平板是剛剛倒的，氨芐的作用肯定存在。氨芐也沒問題，別人剛用過我直接拿過來用的，別人的結(jié)果沒出問題。 以前挑過很多次菌，菌液pcr也做過，，都沒有發(fā)生這種狀況。我覺得我的操作沒有問題，但是實在是找不到原因了，哪位高手給指點一下啊…… 昨天剛剛又轉(zhuǎn)化了一次，現(xiàn)在已經(jīng)有14個小時了，肉眼只能看到幾個小菌落。一般來說12個小時應(yīng)該就長得差不多了。轉(zhuǎn)化涂板用的是新配制的氨芐板，菌落生長緩慢會不會是感受態(tài)細菌的問題呢？細菌沒有接受外源抗性質(zhì)粒的活性了，但還是能緩慢的在含氨芐的平板上生長，在含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)24個小時也不會快速的生長。是不是這樣呢？ |
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zero19871029
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【答案】應(yīng)助回帖
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卡西西VS鳴人(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵發(fā)帖交流 2014-11-29 20:53:28
卡西西VS鳴人(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵發(fā)帖交流 2014-11-29 20:53:28
| 氨芐板長起來很快的。。我前陣子也在連EGFP，12個小時足足狗狗了。17個小時再長出來的。。應(yīng)該已經(jīng)不是你要的了。。能P出條帶來也是正常，因為我那時候做的時候也是，里面壓根沒有EGFP，還生生的給我拉出了差不多大小的條帶來，后來測序出來什么都沒有，真是醉了。。感覺根據(jù)你的描述真心找不到啥問題，要不EGFP載體出了問題，要不感受態(tài)有問題。。EGFP你重新鑒定一下吧。如果正確，那就換批感受態(tài)。。再者。。我也沒辦法啦！ |
4樓2014-11-29 20:29:01
baishujun
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5樓2016-04-18 21:30:23
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6樓2016-11-03 11:17:16
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申請回稿延期一個月，編輯同意了。但系統(tǒng)上的時間沒變，給編輯又寫郵件了，沒回復(fù)
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wangf9518 2026-03-17 | 4/200 |
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[考研] 274求調(diào)劑 +6 | S.H1 2026-03-18 | 6/300 |
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[考研] 收復(fù)試調(diào)劑生 +4 | 雨后秋荷 2026-03-18 | 4/200 |
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[考研] 280求調(diào)劑 +6 | 咕嚕曉曉 2026-03-18 | 7/350 |
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[考研] 278求調(diào)劑 +5 | 煙火先于春 2026-03-17 | 5/250 |
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[考研] 277調(diào)劑 +5 | 自由煎餅果子 2026-03-16 | 6/300 |
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[考研] 268求調(diào)劑 +8 | 一定有學(xué)上- 2026-03-14 | 9/450 |
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[考研] 085601求調(diào)劑 +4 | Du.11 2026-03-16 | 4/200 |
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[考研] 一志愿蘇州大學(xué)材料工程（085601）專碩有科研經(jīng)歷三項國獎兩個實用型專利一項省級立項 +6 | 大火山小火山 2026-03-16 | 8/400 |
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[考研] 一志愿南京大學(xué)，080500材料科學(xué)與工程，調(diào)劑 +4 | Jy? 2026-03-16 | 4/200 |
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[考研] 274求調(diào)劑 +5 | 時間點 2026-03-13 | 5/250 |
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[考研] 070300化學(xué)學(xué)碩求調(diào)劑 +6 | 太想進步了0608 2026-03-16 | 6/300 |
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[考研] 277材料科學(xué)與工程080500求調(diào)劑 +3 | 自由煎餅果子 2026-03-16 | 3/150 |
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[考研] 材料與化工 323 英一+數(shù)二+物化，一志愿：哈工大 本人本科雙一流 +4 | 自由的_飛翔 2026-03-13 | 5/250 |
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[考研] 304求調(diào)劑 +7 | 7712b 2026-03-13 | 7/350 |
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