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卡西西VS鳴人金蟲 (小有名氣)
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[求助]
連接載體轉(zhuǎn)化后挑單菌落，菌落pcr擴(kuò)出條帶，但是搖菌搖不起來 已有3人參與
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載體是連接有EGFP的瞬時(shí)表達(dá)載體，有氨芐抗性。轉(zhuǎn)化到DH5α中，涂含氨芐的平板。倒置培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)候未見菌落，但是17個(gè)小時(shí)候有菌落，且密度不是很大，單菌落數(shù)不多不少的樣子。我先是挑單菌落搖菌，準(zhǔn)備做菌液pcr，但是37°C轉(zhuǎn)速200培養(yǎng)過夜之后LB培養(yǎng)基仍然是清亮的，沒有任何菌生長。再挑單菌落，換了別人配的LB震蕩培養(yǎng)，仍然是沒有搖起來。最后我挑單菌落加到20μl的水中做菌落pcr，設(shè)置了空白對照，pcr結(jié)果顯示空白對照沒有條帶，其它菌落pcr只有兩個(gè)未擴(kuò)出條帶。將pcr條帶最亮的幾管分別加到4mlLB培養(yǎng)基中，再加入4μl氨芐，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。最后居然還是沒有菌落生長，培養(yǎng)基一片清亮······ 我在網(wǎng)上查到說，挑單菌落的時(shí)候可能挑到平板上未干的連接液，連接液里可能含有未連接到載體上的目的片段，所以pcr可以擴(kuò)出條帶。但是我很確定我挑到了菌落，肉眼看到菌落慢慢的分散開來然后水變渾濁。即使是空載，搖菌應(yīng)該也能搖起來。平板是剛剛倒的，氨芐的作用肯定存在。氨芐也沒問題，別人剛用過我直接拿過來用的，別人的結(jié)果沒出問題。 以前挑過很多次菌，菌液pcr也做過，，都沒有發(fā)生這種狀況。我覺得我的操作沒有問題，但是實(shí)在是找不到原因了，哪位高手給指點(diǎn)一下啊…… 昨天剛剛又轉(zhuǎn)化了一次，現(xiàn)在已經(jīng)有14個(gè)小時(shí)了，肉眼只能看到幾個(gè)小菌落。一般來說12個(gè)小時(shí)應(yīng)該就長得差不多了。轉(zhuǎn)化涂板用的是新配制的氨芐板，菌落生長緩慢會(huì)不會(huì)是感受態(tài)細(xì)菌的問題呢？細(xì)菌沒有接受外源抗性質(zhì)粒的活性了，但還是能緩慢的在含氨芐的平板上生長，在含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)也不會(huì)快速的生長。是不是這樣呢？ |
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hmily890404
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【答案】應(yīng)助回帖
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卡西西VS鳴人(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)發(fā)帖交流 2014-11-29 20:53:28
卡西西VS鳴人(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)發(fā)帖交流 2014-11-29 20:53:28
| 氨芐板長起來很快的。。我前陣子也在連EGFP，12個(gè)小時(shí)足足狗狗了。17個(gè)小時(shí)再長出來的。。應(yīng)該已經(jīng)不是你要的了。。能P出條帶來也是正常，因?yàn)槲夷菚r(shí)候做的時(shí)候也是，里面壓根沒有EGFP，還生生的給我拉出了差不多大小的條帶來，后來測序出來什么都沒有，真是醉了。。感覺根據(jù)你的描述真心找不到啥問題，要不EGFP載體出了問題，要不感受態(tài)有問題。。EGFP你重新鑒定一下吧。如果正確，那就換批感受態(tài)。。再者。。我也沒辦法啦！ |
4樓2014-11-29 20:29:01
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