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baishaoyun新蟲 (小有名氣)
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[求助]
重組質(zhì)粒構(gòu)建一直失敗 已有4人參與
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我最近在做原核表達(dá)方面的實(shí)驗(yàn)，之前老師已經(jīng)構(gòu)建好了重組質(zhì)粒，但誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)誘導(dǎo)后和未誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)量并無差別，因?yàn)樽龅氖强缒さ鞍装舛沃亟M表達(dá)，就重新設(shè)計(jì)引物切除了臨近跨膜區(qū)的六個(gè)堿基重新構(gòu)建重組質(zhì)粒，但每次酶切膠回收，連接，轉(zhuǎn)化，最后菌液PCR鑒定都是陰性，或者弱陽性而提取質(zhì)粒鑒定為陰性結(jié)過，擔(dān)心PCR產(chǎn)物片段的雙酶切可能效果不好，就連了T載體送公司測(cè)序驗(yàn)證正確后再雙酶切做，然后與相同雙酶切的pet28a-EGFP質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，依然是每次菌液PCR鑒定都無目的條帶出現(xiàn)，而作為對(duì)照的連接T載體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌菌液PCR鑒定強(qiáng)陽性，前前后后總共做了十多次都沒有成功，求大神幫忙分析下可能的問題所在。 @youlinglyw @biostar2009 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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baishaoyun
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長出來的菌落現(xiàn)在懷疑是原來的重組質(zhì)粒目的片段沒切下來又發(fā)生了自連，有做菌液PCR弱陽性而提質(zhì)粒陰性的懷疑目的片段導(dǎo)入了菌體但不能自我復(fù)制可能。載體和目的前段比例問題也考慮過，并嘗試過1 :3到1:10之間的多個(gè)比例做連接，但始終不得陽性結(jié)果。雙酶切電泳膠回收的條帶是可以肯定確實(shí)都切下來了并且條帶亮度很好，回收后濃度也都能達(dá)到40-150ng/ul之間 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2016-08-04 12:12:48
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原來構(gòu)建了三種pET28a-目的基因-EGFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌，另外兩種誘導(dǎo)后表達(dá)量都明顯增高，就現(xiàn)在打算重新構(gòu)建的這個(gè)當(dāng)時(shí)表達(dá)量很低。目的片段是和另外兩種重組質(zhì)粒中的一種經(jīng)相同雙酶切(Sac I和Noc I)膠回收后連接轉(zhuǎn)化的。內(nèi)切酶和連接酶都用的TAKARA的 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2016-08-04 11:58:03
baishaoyun
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懷疑過連接酶或連接酶失效的問題，后來都換了新的重新做過了，感受態(tài)，抗生素也重新買了做也是不行，每次培養(yǎng)也都有菌落出現(xiàn)，但菌液PCR鑒定要么陰性，要么顯示弱陽性而提取質(zhì)粒行PCR鑒定無條帶同時(shí)雙酶切切不下來目的條帶。最近做的有一次提質(zhì)粒PCR有弱條帶，但雙酶切鑒定還是沒切下來目的條帶。已經(jīng)做了三個(gè)多月了可，實(shí)在是很無助呀 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2016-08-04 12:04:37
5樓2016-08-04 13:26:27
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可以換NEB的T4連接酶試試 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2016-08-04 14:08:07
7樓2016-08-04 14:42:07
baishaoyun
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一起做的三個(gè)跨膜蛋白基因胞外段的原核表達(dá)，除了現(xiàn)在打算重新構(gòu)建的一個(gè)，另外兩個(gè)構(gòu)建好的表達(dá)都可以，也都送公司測(cè)序過的，應(yīng)該不會(huì)有問題吧 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2016-08-04 17:41:26
baishaoyun
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目的基因，之前老師已經(jīng)做過整個(gè)蛋白的表達(dá)的，表達(dá)量可以的。現(xiàn)在讓我做的是這個(gè)蛋白胞外段的表達(dá)，應(yīng)該不存在毒性問題吧。引物的話，連接T載體和目的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌做的陽性對(duì)照電泳條帶很明顯的，應(yīng)該不會(huì)有多大問題吧？我也想過菌液PCR有可能不準(zhǔn)確，也嘗試過提取質(zhì)粒鑒定，一樣的不行呢。有一次的做質(zhì)粒PCR有弱條帶，里邊會(huì)不會(huì)有可能混有少量重組質(zhì)粒呢？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2016-08-04 17:52:23
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因?yàn)槟闶峭瑫r(shí)做的三個(gè)載體 所以如果只有一個(gè)有問題的話 可能這個(gè)目的片段出問題的幾率大一點(diǎn) 我看樓上說表達(dá)的蛋白有毒性 這個(gè)可能性也很大 不如你查查文獻(xiàn) 看看有沒有類似的情況？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
10樓2016-08-04 18:07:56
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