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關(guān)于構(gòu)建pET28a載體轉(zhuǎn)化后IPTG誘導(dǎo)跑SDS-PAGE膠問題。 已有9人參與
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試驗(yàn)進(jìn)行到了IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后跑SDS-PAGE膠的環(huán)節(jié)，但是試了很多次了一直失敗，我想了很多原因但是都沒成功，跪求各位大神給我點(diǎn)指導(dǎo)，再做不出來畢不了業(yè)了。 首先，我獲得了我的目的基因，與pET28a連接后，成功構(gòu)建載體。我進(jìn)行了菌液PCR驗(yàn)證，質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證，之后是送去測序。所有的結(jié)果足夠表明我已經(jīng)構(gòu)建載體成功了。 之后就是轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌株中。轉(zhuǎn)到BL21表達(dá)菌株時間大概是15年1月份左右，直到過年后回來開始搖菌，誘導(dǎo)，跑膠，問題就是這時候出現(xiàn)的。 以下是我做試驗(yàn)的整個流程，望大神給些建議。 1、誘導(dǎo)與提取目的蛋白 ① 菌種活化。重組載體pET-28a-SAMDC和空質(zhì)粒pET-28a的單菌落，分別接種于25mL LB液體培養(yǎng)基（KanR）的試管中，37℃，180r/min，過夜振蕩培養(yǎng)。 ② 菌種擴(kuò)培。取活化好的菌種按1%的量接種于100mL的LB液體培養(yǎng)基（KanR），搖勻，37℃，200r/min，振蕩培養(yǎng)3h。 ③ 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。向菌液中分別加入終濃度的IPTG（0.1、0.5、1.0 mmol/L）作誘導(dǎo)劑，37℃，180r/min，振蕩培養(yǎng)4h（3、4、5、6h）。 ④ 目的蛋白的提取。 A. 經(jīng)誘導(dǎo)后取1mL菌液，4℃ 12000g，10min收集菌體;吸出菌液，用0.5mL預(yù)冷的50mmol/LTris-Cl（pH7.4）漩渦振蕩使沉淀的菌體復(fù)懸，4℃ 12000g，離心10min；再次吸出上清液，小心地吸凈管壁上的液滴，盡可能地使沉淀不帶有殘留的液體；加入100uL ddH2O，漩渦振蕩使沉淀復(fù)懸，一旦菌體分散開來立即加入等體積的1%×SDS磷酸緩沖液，繼續(xù)振蕩20s；超聲波處理。超聲處理為7min，超3s，停10s，功率為75w。超聲波處理后，樣品4℃ 12000g，10min，將上清移至另一管中，沉淀用少量1%SDS溶解，分別加入等體積的2×SDS凝膠上樣緩沖液；快速離心，將菌懸液收集在離心管底部，沸水浴中放置5min；分別取15uL樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。 圖片即為SDS膠跑完后的狀態(tài)。我的蛋白預(yù)測應(yīng)該是在40kDa左右，可是在40kDa左右處根本沒有我的目的蛋白。反而在30kDa處出現(xiàn)奇怪的條帶... 做了幾次都是這樣的狀態(tài)。同實(shí)驗(yàn)室的也有人在做這一步，她的蛋白預(yù)測大小為38kDa，但是跑出來的膠跟我的一模一樣。 還有一個同學(xué)她是前兩次做成功了可以明顯看到目的蛋白表達(dá)，在60kDa左右，但是從大概4月份開始條帶就沒有了，我們一直找不到原因，難道這個也是可以傳染的？ 去問實(shí)驗(yàn)室的小老師，老師說可能是我們IPTG誘導(dǎo)的時間有問題，但是按照他說的方法重新試了也不行。難道是因?yàn)轳Z化時間太久所以BL21這個菌太淘氣了所以把我們的載體吐出去了？但是這種可能性也不算大啊，我們也沒有反復(fù)凍融，更何況我們重新驗(yàn)證了，BL21菌株中確實(shí)有我們的質(zhì)�！，F(xiàn)在真的是想不出來到底問題出在哪里。唯一能想到的就是IPTG失效了，下次準(zhǔn)備把所有的試劑都重新配一遍，再重新來一次。還有別的什么原因會出現(xiàn)這樣的情況么？如果膠做的不對會使條帶消失么？？求！�。。。。。。」蚯螅。。。。。。。≈x謝大家了。 IMG_1062.JPG |
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LZ你趕緊做一個空載的全細(xì)胞、破碎后上清、沉淀的PAGE，驗(yàn)證一下細(xì)胞沉淀里那條帶在空載里是否存在。從全細(xì)胞圖上看我不覺得是包涵體，你全細(xì)胞是怎么跑的帶？包涵體的可能性一定要排除。 如果上面驗(yàn)證不是包涵體的話，那問題就很多了。你需要做很多的篩查。 1.測一下你載體上連接基因前端的T7啟動子附近的序列，排除一下載體的問題， 2.因?yàn)槟銈儗?shí)驗(yàn)室是集體出問題，我感覺你們的菌株需要換一下，你們的菌株是BL21還是BL21(DE3），如果是BL21你們誰都別想誘導(dǎo)出蛋白~，建議明天趕緊去其他做分子的實(shí)驗(yàn)室去借一管確定能誘導(dǎo)出蛋白的編號為BL21（DE3）宿主菌來做。問題多半出現(xiàn)在這里，你們實(shí)驗(yàn)室的菌株可能在DE3區(qū)段出現(xiàn)變化。 3.我估計(jì)不是基因序列本身的問題，你也可以檢測一下你基因的稀有密碼子看一下有問題沒有。 |
16樓2015-05-14 21:36:24
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從下到上條帶順序依次是：Marker（94kDa，66.2，45,33,26）、轉(zhuǎn)空載體、轉(zhuǎn)SAMDC基因0.1mM IPTG誘導(dǎo)總蛋白，轉(zhuǎn)SAMDC基因0.1mM IPTG誘導(dǎo)上清蛋白、轉(zhuǎn)SAMDC基因0.1mM IPTG誘導(dǎo)沉淀蛋白、轉(zhuǎn)SAMDC基因0.5mM IPTG誘導(dǎo)總蛋白、轉(zhuǎn)SAMDC基因0.5mM IPTG誘導(dǎo)上清蛋白、轉(zhuǎn)SAMDC基因0.5mM IPTG誘導(dǎo)沉淀蛋白、轉(zhuǎn)SAMDC基因1mM IPTG誘導(dǎo)總蛋白、轉(zhuǎn)SAMDC基因1mM IPTG誘導(dǎo)上清蛋白、轉(zhuǎn)SAMDC基因1mM IPTG誘導(dǎo)沉淀蛋白。 33kDa左右處確實(shí)是有一條條帶，但是大小與我預(yù)測的不相符。我的預(yù)測大小是40kDa左右，我同學(xué)預(yù)測大小是38kDa左右，我們倆同時跑膠跑出來的東西是一模一樣的，無論是條帶的大小，還是條帶的顏色深淺，甚至是位置... |
9樓2015-05-14 14:37:43
linxiaolin08
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10樓2015-05-14 14:38:59
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