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原核表達(dá)和SDS-PAGE
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我做的4個(gè)基因的克隆 然后轉(zhuǎn)到pET-28a上了，然后進(jìn)行了一系列的檢測(cè)，都合適了，最后跑SDS-PAGE，具體操作如下： 將檢測(cè)合適的轉(zhuǎn)到BL21(DE3)里的保存的菌液 搖菌 37度過(guò)夜； 第二天，1:50的比例轉(zhuǎn)搖； OD600=0.6-0.8時(shí)停止轉(zhuǎn)搖（時(shí)間是下午2點(diǎn)）， 然后置于4度，待晚上7點(diǎn)加IPTG誘導(dǎo)，28度，過(guò)夜（體積為20ml） 次日，將誘導(dǎo)好的，沒(méi)有誘導(dǎo)的，離心，收集上清，并將沉淀加滅過(guò)菌的水稀釋至總體積為20ml,然后超聲波處理 然后跑SDS-PAGE， 濃縮膠為4% 分離膠為12% 結(jié)果什么都沒(méi)有 不知道為什么 文獻(xiàn)上看別人都是這樣做的啊 為什么我的就是不行呢？ 麻煩大家?guī)兔Ψ治鲆幌拢?br /> 謝謝！ |
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cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| 什么都沒(méi)有是什么意思？SDS-PAGE染膠沒(méi)有條帶嗎？還是說(shuō)沒(méi)有誘導(dǎo)出特異的條帶？確定超聲破碎的效果了嗎？如果菌破了，總會(huì)有細(xì)菌自己的蛋白吧。超聲所得的蛋白是可溶蛋白，有可能誘導(dǎo)的蛋白形成包涵體了。可以試試上細(xì)菌總蛋白，看有沒(méi)有誘導(dǎo)出來(lái)。此外，IPTG誘導(dǎo)條件（溫度、時(shí)間、濃度）都和蛋白有關(guān)，需要自己優(yōu)化。單純按文獻(xiàn)來(lái)是不行的。 |
2樓2013-01-08 14:50:15
3樓2013-01-08 21:02:29
snoopyzxx
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4樓2013-01-08 21:25:54
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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你用的是Novagen的pET系統(tǒng)，建議你參考pET系統(tǒng)操作手冊(cè)，這可能是做原核表達(dá)最經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。 http://lifeserv.bgu.ac.il/wb/zar ... system%20manual.pdf 里面有關(guān)于pET系統(tǒng)的表達(dá)，純化等相關(guān)的具體信息，祝好運(yùn)！ |
5樓2013-01-08 21:49:17
cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-01-09 12:00:29
kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-01-09 12:00:29
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菌的超聲一般是挺好做的，超聲時(shí)候菌濃度的確不能太稀，否則可溶蛋白的濃度小，需要上樣量大才能看到。一般是留取1/10的菌，離心，用500ul上樣buffer重懸，煮5min，這個(gè)算是預(yù)留的菌體總蛋白。剩余的菌液離心，積濃縮5倍去超聲。取超聲后應(yīng)該看到菌體從渾濁變得有些透明。當(dāng)然如果形成大量包涵體的話，還是渾濁的。超好的樣品離心取上清。取100ul樣品+100上樣buffer變性，算是可溶蛋白部分，剩余超好的樣品凍存。沉淀用超聲時(shí)同樣體積的水重懸，取100ul加100ul上樣buffer變性，為沉淀部分。分別取5-10ul的各個(gè)樣品電泳檢測(cè)。 |
6樓2013-01-09 07:53:57
406856929
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7樓2013-01-16 13:16:35
8樓2013-01-16 19:52:58
9樓2013-01-16 19:54:08
10樓2014-07-07 10:36:09
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