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膜蛋白表達(dá)問題
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我最近在做原核生物的膜蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)，大致是將目的基因克隆到pET-30a的表達(dá)載體上，然后轉(zhuǎn)化到BL21-DE3的感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE電泳，觀察結(jié)果�？墒乾F(xiàn)在的問題是根本就沒有目的蛋白條帶，所以求有經(jīng)驗(yàn)的蟲友們不吝賜教。不勝感激…… |
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9樓2011-07-27 10:35:18
10樓2011-08-03 22:46:38
gwbk
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【答案】應(yīng)助回帖
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dhd997(金幣+5, MolEPI+1): good 2011-07-25 19:53:20
101202139(金幣+4): 2011-07-25 20:13:40
dhd997(金幣+5, MolEPI+1): good 2011-07-25 19:53:20
101202139(金幣+4): 2011-07-25 20:13:40
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正在做這方面實(shí)驗(yàn)，你的情況說的不是很清楚。 1，通過別的手段鑒定是否表達(dá)，如構(gòu)建的克隆基因有某方面功能可以直接用于篩選。我現(xiàn)在做的從克隆構(gòu)一直做到抗性篩選成功，底物濃度從0-0.5，平板抗性梯度很明顯~ 2，菌體PCR或者提質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。 3，測序。 把前期工作做好，然后開始誘導(dǎo)表達(dá)。 4，蛋白電泳 誘導(dǎo)濃度：IPTG誘導(dǎo)過夜誘導(dǎo)，濃度0.5mM，37℃，在加IPTG誘導(dǎo)的同時(shí)加0.1M的底物增大選擇壓力。 5，離心除去菌液上清，加PBS，菌體超聲破碎，一部分離心分為破碎上清和沉淀，一部分跑全蛋白。理論上膜蛋白跑全蛋白就行。 6，優(yōu)化誘導(dǎo)條件。括溫度、時(shí)間等。你可以搜索一下論壇，很多這方面的帖子。 |
2樓2011-07-25 16:52:24
gwbk
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amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-25 20:42:57
amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-25 20:42:57
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如果37℃過夜都不表達(dá)，其他溫度誘導(dǎo)也不會(huì)太理想吧？~ 膜蛋白做起來難啊。 這是pET手冊的內(nèi)容： 溫度 37℃生長常常會(huì)使一些蛋白累積形成包涵體，而30℃生長則可能產(chǎn)生可溶的和有活性的蛋白(Schein and Noteborn, 1989)。如果你打算利用一些pET 載體中的信號(hào)肽序列輸出蛋白的話，在25℃或30℃生長和培養(yǎng)可能是最優(yōu)化的。在某些情況下，低溫(15-20℃)延長誘導(dǎo)時(shí)間（過夜）可以使溶解性蛋白的產(chǎn)量達(dá)到最大。 |
3樓2011-07-25 19:40:39
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首先，克隆肯定是沒有問題的。酶切驗(yàn)證過，而且也測過序列，完全正確。 其次，在誘導(dǎo)表達(dá)蛋白時(shí)，我的膜蛋白A大小是37.5KD，跑SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)有差不多大小的蛋白，另外我又做了膜蛋白B的表達(dá)（目的大小是53.1ＫＤ），跑SDS-PAGE，沒有目的條帶，而且發(fā)現(xiàn)膜蛋白A的膠圖與膜蛋白B的膠圖很類似。所以很有可能是我的表達(dá)系統(tǒng)的問題，下一步就選擇一種普通的蛋白作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)膜蛋白A的目的大小條帶也在普通蛋白膠圖上�？偠灾�，膜蛋白A、膜蛋白B在表達(dá)宿主菌中均沒有表達(dá)。不知道是什么情況？ 最后，你說的“我現(xiàn)在做的從克隆構(gòu)一直做到抗性篩選成功，底物濃度從0-0.5，平板抗性梯度很明顯~”這句話沒有太明白。我的目的基因沒有某方面的功能。 本人是新手，還望多多指點(diǎn)…… |
4樓2011-07-25 20:13:03
5樓2011-07-25 20:17:28
ztiger
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6樓2011-07-25 21:55:16
gwbk
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 很有條理，再次獎(jiǎng)勵(lì)！ 2011-07-25 23:27:35
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): 很有條理，再次獎(jiǎng)勵(lì)！ 2011-07-25 23:27:35
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就是從得到該基因，克隆至載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TransT1，提質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化目的菌株，然后做抗性梯度驗(yàn)證這個(gè)過程。 我做的是某氨基酸輸出蛋白，是一種膜蛋白，約200aa，抗性梯度很漂亮，涉及專利  。因?yàn)楸磉_(dá)這個(gè)輸出蛋白，肯定會(huì)引起菌體對(duì)該氨基酸有較大抗性，所以使用含有不同濃度該氨基酸的平板驗(yàn)證是否有抗性。我已經(jīng)驗(yàn)證出2個(gè)基因了。還是有些問題的。 1，如果某一個(gè)pET不表達(dá)，一系列的pET可能都不表達(dá)，有些人這么認(rèn)為，我沒有經(jīng)歷過，供你參考。為什么pET不表達(dá)，這個(gè)。。。好難啊，我也不知道。 2，膜蛋白確定可以表達(dá)？某些基因難表達(dá)，或不表達(dá)~我去，這個(gè)，有點(diǎn)難以接受啊，有相關(guān)資料嗎？可以查一下。 3，原核生物的膜蛋白合不合適BL21表達(dá)。 如果是上述原因，建議換基因，換載體。 4，得到蛋白質(zhì)序列，做密碼子優(yōu)化。這一步或許可以解決很多問題。因?yàn)槟吃四さ鞍酌艽a子肯定不同于大腸桿菌密碼子，我做的這個(gè)膜蛋白是通過基因合成的方式得到的：NCBI得到蛋白質(zhì)序列——根據(jù)宿主（大腸桿菌）優(yōu)化密碼子（優(yōu)化后的密碼子NCBI比對(duì)跟原核酸序列沒有任何相關(guān)性）——克隆表達(dá)，有用rosetta（de3菌株）的，可以表達(dá)稀有密碼子。 5，western blot 看是不是真的木有表達(dá)。 6，有木有異源信號(hào)肽？膜蛋白信號(hào)肽可能影響表達(dá)。 7，有木有可能是二聚體或多聚體，你再看看？ 8，突變造成的終止或不表達(dá)，pET載體突變造成的不表達(dá)也不能排除（轉(zhuǎn)化到pET后測序正確可以排除這個(gè)）。 9，優(yōu)化各種條件，甚至包括培養(yǎng)條件，搖床轉(zhuǎn)速，誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)溫度。 糾結(jié)的膜蛋白~ |
7樓2011-07-25 23:05:37
8樓2011-07-26 09:25:59
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